【摘要】：目的:急性肝損傷是各種因素導致的肝臟急性損害,轉氨酶升高,肝功能異常。雙環(huán)醇已在臨床上廣泛應用,有明確的保肝降酶效果。既往已發(fā)現的雙環(huán)醇保肝機制有:保護肝細胞膜和線粒體功能,清除自由基,抑制內質網應激,誘導熱休克蛋白表達,抑制炎癥因子釋放等。自噬是真核細胞在遭遇饑餓、損傷、缺氧等影響細胞生存的條件下產生的一種自我保護機制。既往研究中發(fā)現在急性肝損傷中有自噬的發(fā)生。雙環(huán)醇保肝機制是否有自噬參與研究尚少。本研究用CCl_4誘導C57BL/6小鼠急性肝損傷并加用雙環(huán)醇預保護,評估雙環(huán)醇對小鼠肝臟自噬通路及抗氧化應激相關通路指標的影響。探索自噬及抗氧化應激在雙環(huán)醇保肝機制中所起的作用。方法:1、動物實驗:腹腔注射體積比50%的CCl_4 40ul誘發(fā)急性肝損的模型。30只6-8周齡的雄性C57BL/6小鼠隨機分成五組:正常組,CCl_4 24 h組,CCl_4 48 h組,CCl_4+雙環(huán)醇24 h組,CCl_4+雙環(huán)醇48 h組。于CCl_4給藥后24h、48h分別處死相應組小鼠,留取血及肝臟標本,檢測血清ALT變化。HE染色評價鼠肝的病理結構的變化。Western Blot檢測肝臟自噬通路相關蛋白Atg12、Atg7、Atg5、p62、LC3、Beclin-1、mTOR等的改變情況。透射電鏡觀察肝細胞內自噬體及自噬溶酶體的變化。RT-PCR檢測抗氧化應激相關分子在mRNA水平的變化。2、細胞實驗:使用HepG2細胞誘導細胞損傷模型,雙環(huán)醇或3-MA預先處理。CCl_4刺激2h后提蛋白,Western Blot檢測mTOR、p62、LC3等自噬相關蛋白的表達。將已構建好的GFP-LC3質粒轉染進HepG2細胞,單用雙環(huán)醇刺激及合用雙環(huán)醇和3-MA刺激細胞進行比較。熒光顯微鏡下觀察拍照并計數綠色熒光點的數量。3、全部數據應用SPSS20.0軟件分析,p0.05認為有統(tǒng)計學意義。結果:1、動物實驗中,通過血清學分析發(fā)現,CCl_4造模組小鼠血清ALT較正常組明顯升高(P0.001),CCl_4造模后雙環(huán)醇治療組ALT較造模組顯著降低(P0.001)。通過病理學分析發(fā)現,正常組小鼠肝臟病理未見異常,CCl_4造模組小鼠肝臟病理可見細胞變性壞死,雙環(huán)醇治療組病理顯示變性壞死得到明顯修復。2、動物實驗中,將肝組織蛋白提取,進行自噬相關蛋白分析發(fā)現,與正常組和CCl_4造模48h組比,雙環(huán)醇治療24h及48h組Atg7、LC3 II、Beclin-1、p62在蛋白水平明顯升高,P-mTOR明顯下降(P0.05)。CCl_4造模24h組也可見p62及LC3 II蛋白水平升高。Atg5和Atg12未見顯著改變。3、動物實驗中,提取肝組織mRNA,進行基因水平分析發(fā)現,與正常組和CCl_4造模組比,CCl_4+雙環(huán)醇治療組肝組織的抗氧化應激相關分子HO-1、NQO1、GSTA-1在mRNA水平明顯升高,Keap1及p62在mRNA水平也上調(P0.01)。4、細胞實驗中,與正常組相比,CCl_4+雙環(huán)醇治療組p62、P-mTOR蛋白水平下調,LC3 II上調(P0.05),以上變化可被自噬抑制劑3-MA逆轉。熒光顯微鏡下進一步驗證,向HepG2細胞轉染載有GFP-LC3基因的質粒,雙環(huán)醇治療組綠色熒光點(表示自噬體)較正常組明顯增多,加3-MA抑制后熒光點數量減少(P0.01)。結論:在急性肝損傷治療中,雙環(huán)醇可使血清ALT明顯下降,使變性壞死的肝組織明顯改善。這種改善與自噬通路相關,其中自噬相關蛋白Atg7、LC3 II、Beclin-1、p62、P-mTOR起到關鍵作用。同時發(fā)現該通路中p62與Keap1-Nrf2抗氧化應激通路有關,與其下游HO-1、NQO1、GSTA-1分子相關,進而使肝細胞抗氧化應激能力增強�？傊�,雙環(huán)醇通過上調肝細胞自噬水平及加強抗氧化應激能力來保護CCl_4誘導的急性肝損傷。
【圖文】：

前言毒感染、化學性毒物、肝毒性藥灌注損傷等原因引起的肝功能異酶升高，影響肝細胞功能，可發(fā)合物，其誘導的肝損傷模型是一最終進入肝內，經肝微粒體細胞·和過氧化三氯甲基自由基 OO質網膜上的磷脂分子發(fā)生共價結影響線粒體代謝，，產生活性氧，等最終引起廣泛肝損傷[3]。

真核細胞內自噬的基本過程
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R575

【參考文獻】

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1 劉詩o

本文編號：2686711