【摘要】：目的:沒(méi)食子酸(GA)作為食品領(lǐng)域常用的抗氧化劑,其生物活性的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用尚未深入展開(kāi)。本研究擬通過(guò)制備的GA-卵磷脂復(fù)合物擴(kuò)展沒(méi)食子酸生物活性的應(yīng)用,并利用計(jì)算機(jī)模擬方法分析復(fù)合物可能具備的生物活性,為這一天然植物活性成分的實(shí)際應(yīng)用提供新的思路和研究基礎(chǔ)。此外,酒精相關(guān)的癌癥死亡率占全世界所有癌癥死亡率的5.8%,而酒精性肝病(ALD)在現(xiàn)代社會(huì)也有著非常高的罹患率、死亡率。本文擬通過(guò)研究沒(méi)食子酸-卵磷脂復(fù)合物對(duì)酒精性肝病鐵過(guò)載的保護(hù)作用,探討其可能的作用機(jī)制,為ALD患者的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。方法:第一部分:通過(guò)單因素(One-factor)實(shí)驗(yàn),尋找影響以大豆卵磷脂為載體的GA-磷脂復(fù)合物的實(shí)驗(yàn)因素并利用響應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)化GA-磷脂復(fù)合物制備方案。使用紫外分光光度法、紅外分光光度法、差示掃描量熱法、X射線衍射相分析法以及掃描電鏡法等分析化學(xué)技術(shù)對(duì)所制備的物質(zhì)進(jìn)行表征與分析。最后通過(guò)測(cè)定復(fù)合物的表觀油水分配系數(shù)觀察復(fù)合物的脂溶性。第二部分:運(yùn)用理論化學(xué)方法建立一個(gè)可預(yù)測(cè)分子間相互作用的計(jì)算機(jī)模擬模型考察復(fù)合物的分子結(jié)構(gòu)、明確復(fù)合物中沒(méi)食子酸分子與卵磷脂分子之間的結(jié)合方式,并采用分子動(dòng)力學(xué)方法觀察復(fù)合物分子分別在酒精和水條件下與其靶蛋白的親和度。第三部分:分別從DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、亞油酸自氧化抑制能力、Fenton羥自由基清除能力和對(duì)Fe~(3+)的還原能力5個(gè)方面對(duì)GA-磷脂復(fù)合物的體外抗氧化活性進(jìn)行研究。第四部分:通過(guò)酒精灌胃法建立了小鼠酒精性肝損傷鐵過(guò)載模型,并用復(fù)合物進(jìn)行干預(yù)。檢測(cè)血清轉(zhuǎn)氨酶、肝臟脂質(zhì)代謝、抗氧化、鐵代謝等生化指標(biāo),考察GA-卵磷脂復(fù)合物對(duì)酒精性肝鐵過(guò)載的保護(hù)作用,并通過(guò)分析肝臟鐵相關(guān)蛋白的表達(dá)情況,初步探討其對(duì)ALD鐵過(guò)載保護(hù)作用的可能機(jī)制。結(jié)果:(1)經(jīng)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化研究發(fā)現(xiàn),影響GA-卵磷脂復(fù)合物制備的實(shí)驗(yàn)因素為GA與卵磷脂的物質(zhì)的量比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和GA的質(zhì)量濃度。將響應(yīng)面優(yōu)化的數(shù)學(xué)模型和實(shí)驗(yàn)室條件相結(jié)合,確定了GA磷脂復(fù)合物的制備條件:即選用15 mL乙醇為反應(yīng)溶劑(GA質(zhì)量濃度為12.5 mg/mL),1比1作為GA與磷脂的物質(zhì)的量比,50°C作為反應(yīng)溫度,3h作為反應(yīng)時(shí)間。通過(guò)表征可以確定,利用優(yōu)化的制備條件可以獲得高復(fù)合率的GA磷脂復(fù)合物,該復(fù)合物的理化性質(zhì)不同于GA或卵磷脂單體。通過(guò)表觀油水分配系數(shù)的測(cè)定,結(jié)果表明GA的磷脂復(fù)合物在觀察的pH范圍內(nèi)均具有較好的脂溶性(-1lg P2)。(2)通過(guò)GaMD和分子動(dòng)力學(xué)模擬證明了GA-磷脂復(fù)合物的結(jié)合機(jī)理,即二者是通過(guò)強(qiáng)力的氫鍵相結(jié)合的,磷脂分子通過(guò)其脂肪鏈的卷曲將沒(méi)食子酸分子包裹,使其完全分散于磷脂的物相中。通過(guò)對(duì)復(fù)合物-靶蛋白體系建模,經(jīng)分子動(dòng)力學(xué)模擬后發(fā)現(xiàn)乙醇環(huán)境對(duì)hPTP蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生重大影響,而無(wú)論在乙醇還是水溶液環(huán)境下,復(fù)合物對(duì)維持其靶蛋白hPTP的構(gòu)型穩(wěn)定都具有積極作用。參照自由能的計(jì)算結(jié)果,研究發(fā)現(xiàn)范德華作用能(?Gvdw)、庫(kù)侖力自由能(?Gele)、非極性溶劑自由能(?Gsurf)以及熵值(T?S)均對(duì)復(fù)合物-靶蛋白體系的結(jié)合產(chǎn)生貢獻(xiàn),而極性溶劑自由能(?GGB)易使體系溫度產(chǎn)生波動(dòng),并且范德華作用能為整個(gè)體系的形成提供了主要能量。通過(guò)自由能分解結(jié)果可知,氨基酸殘基Ile34、Ile181、Val49、Val96、Val189、Arg71、Trp94、Tyr107、Tyr148、Leu152、Met166、Pro172、Phe192均有著較高的結(jié)合自由能,說(shuō)明它們可能參與了復(fù)合物與靶蛋白的緊密結(jié)合。(3)通過(guò)體外抗氧化性研究發(fā)現(xiàn),除亞油酸自氧化抑制試驗(yàn)外,復(fù)合物的抗氧化能力均低于沒(méi)食子酸單體,但是GA-卵磷脂復(fù)合物仍呈現(xiàn)出一定的自由基清除能力。亞油酸自氧化體系抑制能力的結(jié)果表明,隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng),復(fù)合物抑制曲線的波動(dòng)最為平緩,其抗氧化穩(wěn)定性較沒(méi)食子酸單體有所提高。通過(guò)Fenton羥自由基清除能力和對(duì)Fe~(3+)的還原能力實(shí)驗(yàn)可知,復(fù)合物仍具備良好的螯合鐵特性。(4)體內(nèi)活性研究中,首先進(jìn)行了GA-卵磷脂復(fù)合物的經(jīng)口急性毒性試驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)給藥劑量為5000 mg/kg BW的小鼠在實(shí)驗(yàn)觀察期間內(nèi)未出現(xiàn)任何不良反應(yīng)與死亡。隨后,結(jié)合文獻(xiàn)資料和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇100 mg/kg BW、200 mg/kg BW和400 mg/kg BW作為GA-卵磷脂復(fù)合物的干預(yù)劑量。經(jīng)12w的酒精干預(yù),相較于空白組,ALD模型組小鼠的血清轉(zhuǎn)氨酶升高(P0.05)、肝臟脂質(zhì)過(guò)氧化加重(P0.05)、脂質(zhì)水平明顯增高(P0.05)、肝細(xì)胞ROS水平和鐵含量激增(P0.05),出現(xiàn)肝臟鐵過(guò)載現(xiàn)象;病理切片觀察發(fā)現(xiàn)小鼠肝細(xì)胞有大量脂肪蓄積,甚至出現(xiàn)纖維化改變。說(shuō)明本研究的造模方法可以成功建立小鼠ALD鐵過(guò)載模型。而相較于模型組,復(fù)合物能有效減輕酒精攝入誘導(dǎo)小鼠的肝臟損傷以及鐵過(guò)載(P0.05),復(fù)合物中劑量組(200 mg/kg BW)的表現(xiàn)與空白對(duì)照組最為接近。檢測(cè)ALD小鼠肝臟鐵代謝相關(guān)蛋白,發(fā)現(xiàn)相較于空白組,乙醇可誘導(dǎo)Ferritin-light、TfR1的表達(dá)增高并降低Hepcidin的表達(dá)(P0.05);而相較于模型組,復(fù)合物可有效改善乙醇對(duì)上述蛋白的影響。結(jié)論:(1)通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化,確定了GA-卵磷脂復(fù)合物制備的最佳條件。對(duì)GA-卵磷脂復(fù)合物進(jìn)行表征,發(fā)現(xiàn)其具有不同于原材料的理化性質(zhì)。通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬,證實(shí)了GA分子與卵磷脂分子是通過(guò)強(qiáng)氫鍵進(jìn)行結(jié)合形成的復(fù)合物,并獲得了復(fù)合物的分子構(gòu)型;通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬,證明其能與靶蛋白hPTP有效結(jié)合,在乙醇環(huán)境下具有穩(wěn)定靶蛋白結(jié)構(gòu)的功能,預(yù)測(cè)GA-卵磷脂復(fù)合物在生物體內(nèi)可能具有積極的生物活性。(2)通過(guò)體外抗氧化性研究,發(fā)現(xiàn)GA-卵磷脂復(fù)合物能有效清除DPPH自由基、ABTS自由基、Fenton反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基,并能有效抑制亞油酸的自氧化,且具有一定的還原Fe~(3+)的能力。(3)成功建立了ALD小鼠肝損傷鐵過(guò)載模型,并證明GA-卵磷脂復(fù)合物能抑制酒精誘導(dǎo)產(chǎn)生的血清轉(zhuǎn)氨酶升高、脂質(zhì)過(guò)氧化和氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS,并且有效改善小鼠血清鐵和肝臟鐵的過(guò)載狀態(tài),對(duì)酒精誘導(dǎo)的ALD小鼠肝損傷和鐵過(guò)載具有保護(hù)作用。(4)GA-卵磷脂復(fù)合物能改善ALD小鼠的肝鐵過(guò)載,推測(cè)可能與Ferritin-light和TfR1蛋白的下調(diào)以及Hepcidin的上調(diào)有關(guān),但其改善ALD鐵過(guò)載的具體機(jī)制需要進(jìn)一步闡明;此外,本研究中GA-卵磷脂復(fù)合物200 mg/kg BW劑量組對(duì)ALD小鼠肝鐵過(guò)載顯示出較好的保護(hù)作用。
【圖文】：

第 3 章 沒(méi)食子酸卵磷脂復(fù)合物結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)活性的計(jì)算機(jī)模擬研究Root mean square deviation, RMSD）的計(jì)算可對(duì)模擬后兩個(gè)體系的整體穩(wěn)定行評(píng)估。經(jīng) RMSD 計(jì)算，乙醇環(huán)境系下，，Apo-hPTP 體系結(jié)構(gòu)相較omplex-hPTP 出現(xiàn)了較大改變，如圖 3.7（A）所示；同時(shí)，本研究也對(duì)上述體系進(jìn)行了水環(huán)境下的 MD 模擬，如圖 3.7（B）。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TS201.4;R575

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