【摘要】：[目的]檢測乙型肝炎病毒染者肝門淋巴結(jié)內(nèi)HBV DNA和HBVcccDNA及乙肝表面抗原,明確肝門淋巴結(jié)內(nèi)HBV的DNA分子存在形式及乙肝表面抗原表達情況,探討肝門淋巴結(jié)內(nèi)HBV在肝移植術(shù)后乙肝復發(fā)過程中的作用。 [方法]實驗分為三部分。 第一部分：建立檢測肝門淋巴結(jié)內(nèi)HBV DNA和HBV cccDNA的檢測體系。根據(jù)入組病例的種族和地理分布特點,在Gen Bank選取HBV的B型、C型全基因序,對比序列差異,在S區(qū)、C區(qū)、X區(qū)內(nèi)選擇相對保守的區(qū)域各設計一對巢式或半巢式引物,當樣本在兩個或三個區(qū)域為陽性時,認為該樣本HBV DNA為陽性；根據(jù)cccDNA的結(jié)構(gòu)和生物學特點,利用PSAD消化去除rcDNA和整合型HBV DNA的干擾后,利用跨越缺口的選擇性引物擴增。以pCP1O質(zhì)粒為陽性對照,對肝組織樣本DNA提取樣本進行檢測,確定引物的最佳退火溫度和檢測靈敏度。 第二部分：慢性乙型肝炎相關肝移植受者肝門淋巴結(jié)的檢測。選取病例為2010年6月至2011年3月因乙肝相關性終末期肝病于我院行肝移植手術(shù)患者共36例,其中男性32例,女性4例,年齡40-65歲,平均54.4±6.8歲,所有患者均為血清HBsAg陽性且HBV DNA定量檢測陰性(小于100IU/mL為的檢測下限)。利用第一部分創(chuàng)建的方法,檢測肝門淋巴結(jié)內(nèi)的HBV DNA及cccDNA。 第三部分：HBsAg陽性肝移植供者肝門淋巴結(jié)的檢測。2010年6月至2011年7月,摘取自HBsAg陽性供者的肝門淋巴結(jié)樣本共9例。利用第一部分建立的方法檢測肝門淋巴結(jié)內(nèi)HBV DNA和cccDNA。利用免疫組化和酶聯(lián)免疫吸附法測定肝門淋巴結(jié)內(nèi)HBsAg的表達。 實驗結(jié)果采用t檢驗和Fisher確切概率法分析。 [結(jié)果] 第一部分：成功建立了檢測肝門淋巴結(jié)內(nèi)HBV DNA和cccDNA的PCR體系。 第二部分：36例慢性乙型肝炎肝移植受者中,30例HBV DNA剛性,陽性率為83.3%(30/36),HBV DNA的三個獨立檢測區(qū)域,S區(qū)、C區(qū)和X區(qū)陽性率分別為86.1%(31/36)、86.1%(31/36)、66.7%(24/36)。17例HBV cccDNA陽性,陽性率47.2%(17/36)。 對該組病例,根據(jù)術(shù)前是否應用核苷類藥物,分為用藥組(22入)和未用藥組(14人),其中用藥組分為用藥時間3個月(14人)和≤3個月(8人)兩個亞組。HBV DNA陽性率：用藥組(72.7%,16/22)與未用藥組(100%,14/14)差異無顯著的統(tǒng)計學意義(P=0.062),用藥組中用藥時間3個月(71.4%,10/14)與≤3個月(75%,6/8)組間差異無顯著的統(tǒng)計學意義(P=1.000)。HBV cccDNA陽性率：用藥組(22.7%,5/22)較未用藥組(85.7%,12/14)顯著降低(P=0.000),用藥組中用藥時間3個月組(7.1%,1/14)較≤3個月組(50%,4/8)顯著降低(P=0.039)。 第三部分：9例HBsAg陽性肝移植供者中,7例HBV DNA陽性,陽性率為77.8%,HBV DNA三個獨立檢測區(qū)域,S區(qū)、C區(qū)和x區(qū)陽性率分別為77.8%(7/9)、77.8%(7/9)、66.7%(6/9)。5例HBV cccDNA陽性,陽性率55.6%。HBV DNA (P=0.651)及cccDNA (P=0.722)陽性率與第二部無顯著性差異。 免疫組化結(jié)果為可觀察到少量疑似陽性細胞,分布零散。乙肝表面抗原酶聯(lián)免疫：3個檢測呈陽性,陽性率33.3%(3/9),低于肝門淋巴結(jié)中HBV DNA和HBV cccDNA的檢出率 [結(jié)論] 1.成功建立了檢測肝門淋巴結(jié)內(nèi)HBV DNA和HBV cccDNA的PCR體系,雜帶產(chǎn)生較少,方法靈敏度高,可用于相關研究。 2.對HBV感染者,HBV可感染其肝門淋巴結(jié),肝門淋巴結(jié)可能為HBV的肝外儲庫之一,并可能為肝移植術(shù)后乙型肝炎病毒復發(fā)的原因之 3.對血清中HBV DNA滴度低于臨床檢測限的慢性乙肝患者,核苷類藥物應用3個月以上可顯著降低肝門淋巴結(jié)內(nèi)cccDNA的檢出率,表明肝移植術(shù)前核苷類藥物的應用在減少肝外HBV病毒庫方面是有意義的。 4.對HBsAg陽性的HBV感染者,肝門淋巴結(jié)內(nèi)乙型肝炎病毒表面抗原的表達可能受到抑制,需進一步擴大病例觀察。
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R512.62

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