【摘要】： 目的:分子流行病學(xué)方法檢測(cè)乙型肝炎病毒(HBV)病毒株X基因一種新的變異方式。利用酵母雙雜交技術(shù)自健康人肝細(xì)胞cDNA文庫(kù)中篩選HBV X蛋白結(jié)合蛋白基因,并以反向酵母雙雜交方法驗(yàn)證候選結(jié)合蛋白。通過(guò)病毒蛋白-宿主蛋白作用探討X蛋白在肝細(xì)胞內(nèi)的可能存在的分子作用機(jī)制。 方法:自HBV慢性感染患者血清中提取HBV DNA,擴(kuò)增X基因序列,克隆入pMD19 T載體,選擇陽(yáng)性克隆進(jìn)行DNA測(cè)序,與已知HBV基因相應(yīng)序列比較該患者體內(nèi)HBV基因變異位點(diǎn)以及變異形式。選擇克隆X基因序列作為研究靶基因,定向克隆到pDEST32構(gòu)建表達(dá)X基因誘餌質(zhì)粒,命名為pDEST32—X,western blot法驗(yàn)證pDEST32—X的表達(dá)。酵母雙雜交系統(tǒng)篩選人肝細(xì)胞cDNA文庫(kù),選擇陽(yáng)性克隆質(zhì)粒DNA測(cè)序,進(jìn)行生物信息學(xué)技術(shù)分析。根據(jù)正向酵母雙雜交的結(jié)果,PCR法擴(kuò)增TCP1基因構(gòu)建成誘餌質(zhì)粒,將X基因構(gòu)建成獵物質(zhì)粒,反向酵母雙雜交法驗(yàn)證正向篩選候選結(jié)合蛋白。 結(jié)果:自21例患者中共挑選74個(gè)克隆測(cè)序,測(cè)序結(jié)果提示54個(gè)克隆X基因下游大段缺失突變,長(zhǎng)度達(dá)234nt,位于1601-1834nt處,另有1個(gè)克隆發(fā)生245nt缺失突變。成功克隆了HBV X基因,構(gòu)建了pDEST32-X酵母表達(dá)質(zhì)粒及pDEST22-肝細(xì)胞cDNA文庫(kù)。酵母雙雜交篩選獲得18個(gè)陽(yáng)性克隆,其中3個(gè)克隆測(cè)序成功,均為T(mén)CP1蛋白基因。反向雙雜交進(jìn)一步驗(yàn)證了TCP1與HBV X蛋白的相互作用。 結(jié)論:觀察到一種X蛋白變異方式,這種大段缺失突變導(dǎo)致X蛋白下游編碼序列丟失。成功篩選并克隆出肝細(xì)胞中HBV X蛋白相互作用蛋白——TCP1蛋白基因,有利于進(jìn)一步研究HBV X蛋白在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。
【圖文】：

產(chǎn)物長(zhǎng)度存在兩種形式，約 700bp和約 500bp兩種。不同患者來(lái)源病毒PCR產(chǎn)物電泳后展示為3種形式:單獨(dú)700bP(3例)、單獨(dú) 500bp條帶(7例)和兩條不同長(zhǎng)度條帶同時(shí)存在(11例，圖1)。長(zhǎng)度約500bP的PcR產(chǎn)物提示在靶基因內(nèi)部具有缺失突變，其范圍大約200飾左右。 X475X486X284X395X441X482X489M公址r如加的姍溯枷柳100圖1靶基因PCR產(chǎn)物9留L瓊脂糖凝膠電脈圖 2.3DNA測(cè)序結(jié)果:經(jīng)PCR法獲得的靶基因經(jīng)回收后連接入 pMD19T載體，21例患者共克隆出421個(gè)克隆�？紤]到HBV是以準(zhǔn)種形式存在，每例患者的克隆群中至少選擇2個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，共選擇74個(gè)克隆進(jìn)行DNA測(cè)序。測(cè)序結(jié)果存儲(chǔ)于GenBank中:EUO43336一EU043352。經(jīng)過(guò)比較，本研究觀察到的缺失突變株中有54株表現(xiàn)為 nt1601一1834處發(fā)生大段缺失突變，長(zhǎng)度234nt(圖2)，涵蓋了X基因1372一1836nt處的中下游部分

活HIS、Ura、LaeZ三個(gè)報(bào)告基因表達(dá)、而Pn產(chǎn)生相互作用，不能激活報(bào)告基因的表達(dá)。AI，的濃度gen公司酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)指南，將pDEST32一X酵母菌株MaV203，培養(yǎng)于SC/一Le川一T甲八His三養(yǎng)基中驗(yàn)證自激活。并將其中的陽(yáng)性克隆分別、30、40、50mM的3AT濃度梯度培養(yǎng)皿中觀則以ZmM梯度繼續(xù)細(xì)分3AT濃度觀察其生長(zhǎng)構(gòu)建NotI/sall雙酶切定向克隆到pENTRll質(zhì)粒中期相符(圖1)。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類(lèi)號(hào)】：R512.62

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