發(fā)布時(shí)間：2020-05-27 11:43

【摘要】： 科研工作來源:國家自然基金資助項(xiàng)目(30672769);廣東省中醫(yī)藥局資助項(xiàng)目(1050128)。 研究背景:肝纖維化(hepatic fibrosis,HF)主要是由肝臟內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的合成大于降解,致使ECM在肝臟內(nèi)過度沉積所致。它是大多數(shù)慢性肝病所共有的病理特征,也是慢性肝炎、肝硬化等進(jìn)一步發(fā)展、惡化的重要中間環(huán)節(jié)。據(jù)統(tǒng)計(jì),我國患慢性乙型肝炎的病人超過3000萬,每年死于肝炎后肝硬化者有40萬人,而治愈肝硬化的唯一途徑是阻斷肝纖維化。迄今為止,全世界包括我國在內(nèi)的國家尚沒有批準(zhǔn)一個(gè)抗纖維化西藥,中醫(yī)藥抗肝纖維化的實(shí)驗(yàn)和臨床研究已凸現(xiàn)其特有的優(yōu)勢,其中尤以復(fù)方中藥抗肝纖維化的多靶點(diǎn)治療作用更為引人注目。 我們?cè)谌嬲J(rèn)識(shí)慢性肝病肝纖維化病因病機(jī)的基礎(chǔ)上,研制出抗肝纖維化新方保肝寧,它寓疏肝解郁、益氣健脾;活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié);兼清熱利濕解毒等重要治法于一體,應(yīng)用于臨床,療效卓著。在國家自然科學(xué)基金、廣東省自然科學(xué)基金的資助下,我們開展了保肝寧抗肝纖維化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究。保肝寧抑制HSC增殖作用可能與NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān),保肝寧能明顯降低HSC細(xì)胞NF-κB的表達(dá)及IκB的磷酸化。 瘦素(Leptin)是新發(fā)現(xiàn)的促肝纖維化的細(xì)胞因子,目前對(duì)瘦素促肝纖維化的分子機(jī)制研究,國外剛剛起步,國內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道更加少有。因此,我們認(rèn)為系統(tǒng)的研究瘦素及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,并在此基礎(chǔ)上探討中藥保肝寧對(duì)瘦素、瘦素受體及受體后介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響,有助于進(jìn)一步闡明其抗肝纖維化的作用途徑和作用靶點(diǎn),為保肝寧防治和逆轉(zhuǎn)肝纖維化提供更加充分的理論依據(jù),同時(shí),對(duì)于深化和完善肝纖維化的機(jī)制研究具有十分重要的理論意義。 目的和意義:探討保肝寧抗肝纖維化的分子機(jī)制,為保肝寧應(yīng)用于臨床提供充分的理論依據(jù),為開發(fā)抗肝纖維化新藥保肝寧奠定堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。 研究方法:以復(fù)合因素誘導(dǎo)的肝纖維化模型大鼠為研究對(duì)象,觀察保肝寧(方藥由黃芪、桃仁、丹參、黃芩、鱉甲等組成)對(duì)模型大鼠瘦素及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。 50只Wistar大鼠隨機(jī)分為5組,即正常對(duì)照組(A組)、模型組(B組)、秋水仙堿組(C組)、保肝寧大劑量組(D組)、保肝寧中劑量組(E組)。除A組外,其余大鼠于實(shí)驗(yàn)第1d每只皮下注射40%(體積分?jǐn)?shù))CCl_4花生油0.5ml·100g~(-1);以后每3日注射0.3ml·100g~(-1)。除A組外,各組均以普通飼料喂養(yǎng),并以5%乙醇為飲料。A組注射等量花生油,進(jìn)食普通飼料并自由飲水。各組從造模第2天開始,每日給相應(yīng)藥物灌胃,C組每日灌服秋水仙堿0.011mg·100g~(-1),D、E組分別每日灌服保肝寧3.54g·100g~(-1)、1.77g·100g~(-1),B組及A組灌以等量蒸餾水作對(duì)照。第6廚末,處死動(dòng)物,取血和肝組織備用。取新鮮肝組織梯度置于-70℃中保存,用于蛋白印跡實(shí)驗(yàn)(Western blotting analysis);一部分肝組織固定于10%中性福爾馬林溶液,肝組織常規(guī)脫水,石蠟包埋,切片厚5μm,做光鏡觀察和免疫組化用;血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)活性;總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)采用全自動(dòng)生化分析儀檢測;放免法測定血清瘦素(Leptin)水平;光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化;免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測瘦素(Leptin)及瘦素受體(OB-Rb)等的表達(dá)水平;應(yīng)用蛋白印跡試驗(yàn)(Western blotting analysis)檢測瘦素受體(OB-Rb),JAK2(Janus激酶,Januskinase)和轉(zhuǎn)錄活化因子(STAT3)蛋白的表達(dá)水平以及它們的磷酸化水平。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:計(jì)量資料用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,數(shù)據(jù)處理采用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)。 研究內(nèi)容和過程: 1.觀察保肝寧對(duì)模型大鼠的癥狀、體征及肝、脾指數(shù)的影響 模型組大鼠精神不振、消瘦、厭食,飲水減少,大便稀溏,小便色黃而少;肝臟表面較正常組欠光滑,顏色淺,邊緣鈍,質(zhì)地硬,部分標(biāo)本表面凹凸不平,呈小結(jié)節(jié)狀;脾臟明顯腫大,呈暗紅色。各藥物組大鼠精神狀態(tài)、毛色澤、飲食飲水、排便等一般情況均明顯改善,以保肝寧各組改善情況為佳。在增加體重方面,與模型組比較,秋水仙堿、保肝寧大、中劑量均能顯著增加大鼠體重(P＜0.05、P＜0.01、P＜0.01);各藥物組比較差異無顯著性意義(p＞0.05)。各藥物組大鼠肝臟表面較光滑,顏色較紅;脾臟與正常組大鼠相比較無明顯差異。與正常組比較,模型組、各藥物組肝指數(shù)均明顯增加,差異有非常顯著性意義(P均＜0.01),模型組脾臟指數(shù)亦明顯升高,差異有非常顯著性意義(P均＜0.01);與模型組比較,各藥物組均能顯著降低模型大鼠肝、脾指數(shù),差異有顯著性意義(P均＜0.01);其中,保肝寧大劑量組降低肝指數(shù)的作用明顯優(yōu)于秋水仙堿組,差異有顯著性意義(p＜0.05)。 2.觀察保肝寧對(duì)肝纖維化大鼠肝組織形態(tài)學(xué)的影響 光鏡觀察顯示:模型組正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞,肝索排列紊亂,可見肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死,肝細(xì)胞空泡變性散在分布,間質(zhì)增生明顯,膠原纖維構(gòu)成的纖維間隔形成,形成較多完整的假小葉。各藥物組肝小葉樣結(jié)構(gòu)明顯改善,膠原纖維間隔較少,肝細(xì)胞壞死、炎性細(xì)胞浸潤少見,但極少數(shù)大鼠仍有不完全性假小葉。 3.保肝寧對(duì)模型大鼠血清肝功能、血脂的影響 與正常組比較,模型組血清ALT、AST、AST/ALT比值均明顯升高(P均＜0.01),各藥物組ALT、AST水平亦明顯升高(P均＜0.01);與模型組比較,各藥物組血清ALT、AST活性明顯下降,差異有非常顯著性意義(P均＜0.01),保肝寧中劑量組AST/ALT比值也明顯下降,差異有顯著性意義(P＜0.05);保肝寧大劑量組降低AST作用明顯優(yōu)于秋水仙堿(P＜0.05)。與正常組比較,模型組及各藥物組血清TC、TG水平明顯下降,差異有非常顯著性意義(P＜0.01);與模型組比較,保肝寧大、中劑量組血清TC、TG水平明顯升高,差異有非常顯著性意義(P均＜0.01)。其中,保肝寧大劑量升高TC作用明顯明顯優(yōu)于秋水仙堿組(P＜0.05),保肝寧大、中劑量組升高TG作用均明顯優(yōu)于秋水仙堿組(P均＜0.05)。 4.保肝寧對(duì)模型大鼠血清瘦素(Leptin)水平的影響 與正常組比較,模型組及各藥物組血清Leptin水平明顯升高,差異有非常顯著性意義(P＜0.01);與模型組比較,各藥物組則明顯下降(P＜0.01、P＜0.01、P＜0.05);各藥物組降低Leptin作用,差異無顯著性意義(P＞0.05)。 5.保肝寧對(duì)肝纖維化大鼠肝組織瘦素(Leptin)及瘦素受體(OB-Rb)的影響 (1)Leptin的表達(dá):正常組肝細(xì)胞內(nèi)呈陰性或極弱陽性表達(dá),偶見于匯管區(qū)、小葉中央靜脈周圍及肝索Disse腔間隙中。模型組肝內(nèi)Leptin表達(dá)明顯增強(qiáng),數(shù)目增多,呈棕黃色胞質(zhì)型分布;小葉中央靜脈周圍、匯管區(qū)及肝小葉內(nèi)均有大量條索狀、星芒狀瘦素陽性表達(dá),高倍鏡下,陽性表達(dá)主要分布于HSC胞質(zhì)中。各藥物組陽性染色程度較模型組明顯減輕,陽性細(xì)胞數(shù)目減少。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示,與正常組比較,模型組、各藥物組Leptin表達(dá)明顯增多,差異有非常顯著性意義(P＜0.01);與模型組比較,各藥物組均可以降低Leptin的表達(dá),差異有顯著性意義(p＜0.01);各藥物組兩兩比較差異無顯著性意義(P＞0.05)。 (2)OB-Rb表達(dá):正常組肝細(xì)胞內(nèi)呈陰性或極弱陽性表達(dá),偶見于匯管區(qū)、小葉中央靜脈周圍及肝索Disse腔間隙中。模型組肝內(nèi)表達(dá)明顯增強(qiáng),數(shù)目增多,呈棕黃色胞質(zhì)型分布;高倍鏡下,陽性表達(dá)主要分布于非實(shí)質(zhì)細(xì)胞(包括肝星狀細(xì)胞、竇內(nèi)皮細(xì)胞、枯否細(xì)胞等)胞質(zhì)及胞膜上,部分可定位于核。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示,與正常組比較,模型組、各藥物組OB-Rb表達(dá)明顯增多,差異有顯著性意義(P均＜0.01);與模型組比較,各藥物組OB-Rb表達(dá)均無明顯變化,差異無顯著性意義(P均＞0.05);各藥物組OB-Rb的表達(dá)兩兩比較差異無顯著性意義(P＞0.05)。 6.保肝寧對(duì)肝纖維化大鼠肝組織瘦素受體(OB-Rb)及其JAK2-STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響 (1)OB-Rb、JAK2、STAT3蛋白表達(dá)。用Western Blot法檢測肝臟組織細(xì)胞內(nèi)OB—-b、JAK2、STAT3蛋白表達(dá)情況,正常組蛋白表達(dá)量最少,保肝寧和秋水仙堿處理組蛋白條帶顏色均較淺,模型組條帶顏色最深。與正常組比較,模型組、保肝寧大、中劑量組和秋水仙堿組OB-Rb、JAK2、STAT3蛋白程度均增高;與模型組相比,各藥物組的OB-Rb、JAK2、STAT3蛋白表達(dá)顯著降低;保肝寧大、中劑量組和秋水仙堿組相比,OB-Rb、JAK2、STAT3蛋白顯著降低。 (2)JAK2、STAT3蛋白磷酸化水平。用Western Blot法檢測肝臟組織細(xì)胞內(nèi)JAK2、STAT3蛋白磷酸化水平,正常組蛋白磷酸化水平最低,保肝寧和秋水仙堿處理組蛋白條帶顏色均較淺,模型組條帶顏色最深。與正常組比較,模型組、各藥物組P-JAK2、P-STAT3蛋白表達(dá)水平均增高;與模型組相比,各藥物組的P-JAK2、P-STAT3蛋白表達(dá)顯著降低;保肝寧大、中劑量組和秋水仙堿組相比,P-JAK2、P-STAT3蛋白水平顯著降低。 結(jié)論:保肝寧能有效的阻止模型大鼠肝纖維化進(jìn)程,其作用機(jī)制為: 1.保肝寧可以有效的改善肝纖維化模型大鼠的一般情況:如改善模型大鼠的精神狀況,增加體重,改善食欲和飲水等癥狀,提高大鼠生存質(zhì)量;顯著降低模型大鼠肝、脾指數(shù)。 2.形態(tài)學(xué)觀察表明保肝寧能明顯改善破壞的肝小葉結(jié)構(gòu),減輕纖維組織增生;明顯減少膠原纖維間隔、肝細(xì)胞壞死以及炎性細(xì)胞的浸潤等。 3.保肝寧明顯降低纖維化模型大鼠血清ALT、AST含量,TG、TC水平明顯升高,提示保肝寧能有效減輕炎癥反應(yīng),調(diào)節(jié)血脂水平,保護(hù)肝細(xì)胞,從而抑制早期肝纖維化的啟動(dòng)。 4.保肝寧明顯降低纖維化模型大鼠血清Leptin水平,有效的阻止了Leptin與OB-Rb結(jié)合而發(fā)揮的誘導(dǎo)HSC活化和增殖作用。 5.保肝寧明顯抑制纖維化模型大鼠肝組織Leptin的表達(dá),明顯減輕Leptin陽性染色程度,減少陽性細(xì)胞數(shù)目,提示Leptin是保肝寧抗肝纖維化的作用靶點(diǎn)之一。 6.保肝寧有效抑制纖維化模型大鼠肝組織OB-Rb以及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子JAK2、STAT3的蛋白表達(dá),顯著降低JAK2、STAT3蛋白磷酸化水平,提示保肝寧具有抑制OB-Rb及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用,這可能是其抗肝纖維化的分子機(jī)制之一。 綜上所述,保肝寧具有綜合抗肝纖維化的藥理作用,其作用機(jī)制為多途徑、多靶點(diǎn)。抑制Leptin的表達(dá)、抑制OB-Rb及其JAK2/STAT3信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,可能是其抗肝纖維化的分子機(jī)制之一。而這一機(jī)制與抑制炎癥反應(yīng),調(diào)節(jié)血脂水平,保護(hù)肝細(xì)胞,減少細(xì)胞因子所產(chǎn)生的瀑布效應(yīng),從而抑制肝纖維化的啟動(dòng)密切相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R285.5;R575.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2683483