【摘要】：目的： 通過觀察高遷移率族蛋白B1(High mobility group box protein 1,HMGB1)對肝星狀細胞(Hepatic stellate cell,HSC)的激活,以及RAGE在其激活過程中的作用,探討HMGB1對HSC的激活作用及其相關(guān)機制,為肝硬化的防治提供思路和實驗依據(jù)。 方法： 第一部分實驗：HSC復(fù)蘇后,加DMEM培養(yǎng)液于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng),待鋪滿80%后用0.25%胰酶消化,傳代2次至對數(shù)生長期用于實驗。調(diào)整細胞濃度為2～5×105／ml,轉(zhuǎn)至6孔細胞培養(yǎng)板,每孔1ml培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng),細胞單層融合達80%后,換無血清的DMEM培養(yǎng)液孵育2h,使培養(yǎng)細胞均處于G0期用于實驗。實驗分為三組：第一組：對照組(DMEM培養(yǎng)液1m1)；第二組：HMGB1刺激組(HMGB1 0.1ug/m1)；第三組：HMGB1抗體組(加HMGB1抗體20ug/ml培養(yǎng)2小時后+HMGB1 0.1ug/ml)。培養(yǎng)24小時后,采用免疫組化法檢測HSC的α-SMA和TGF-β1的表達,ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中HA、PIIIP、CIV和TGF-β1的含量。 第二部分實驗：復(fù)蘇后的HSC置于DMEM培養(yǎng)液中,放在37℃、5%C02孵箱中培養(yǎng),待細胞融合80%后,以0.25%胰蛋白酶消化傳代,以傳至第二代的細胞用于實驗。實驗分為三組：第一組：(A)對照組(DMEM培養(yǎng)液1ml)；(B)HMGB1刺激組(HMGB10.1ug／ml)；(C)抗RAGE+HMGB1組(加RAGE抗體20ug／ml 2小時后+HMGB1 0.1ug／ml)；第二組：(A)對照組(DMEM培養(yǎng)液1m1)；(B)HMGB1刺激組(HMGB1 0.1ug/m1)；(C)sRAGE+HMGB1組(sRAGE 20ug／ml和HMGB1 0.1 ug／ml混合2小時后加入細胞DMEM培養(yǎng)液中)；第三組：(A)對照組(DMEM培養(yǎng)液1m1)；(B)HMGB1刺激組(HMGB10.1ug/m1)；(C)AGE+HMGB1組(加AGE160ug/ml 2小時后+HMGB1 0.1ug/m1)。培養(yǎng)24小時后,采用免疫組化法檢測HSC中α-SMA和TGF-β1的表達,ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清液中HA、PIIIP、CIV和TGF-β1含量。 結(jié)果： 1.HMGB1對HSC有顯著的激活作用：免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示,對照組HSC未刺激時α-SMA、TGF-β1在細胞質(zhì)中微弱表達；HMGB1刺激24h后(1-SMA、TGF-β1較對照組表達明顯增加(P0.05)；加入HMGB1抗體后,α-SMA、TGF-β1在細胞質(zhì)中表達水平與對照組比較無顯著差別(P0.05),但較HMGB1組比較顯著下降(P0.05)。未刺激時,細胞培養(yǎng)上清液中HA,PIIIP,CIV和TGF-β1含量較少；HMGB1刺激24h后HA、PIIIP、CIV和TGF-β1含量均較對照組明顯增加(P0.05)；加入HMGB1抗體后,HA、PIIIP、CIV和TGF-β1含量與對照組無顯著差別(P0.05),但較HMGB1組明顯下降(P0.05)。 2.RAGE抗體能抑制HMGB1對HSC的激活作用：免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示,在抗RAGE+HMGB1組,HSC細胞質(zhì)中的α-SMA、TGF-β1表達水平較HMGB1組明顯減少(P0.05)；ELISA結(jié)果顯示,抗RAGE+HMGB1組培養(yǎng)液中的HA、PIIIP、CIV和TGF-β1含量較HMGB1組顯著下降(P0.05)；抗RAGE+HMGBI組的免疫細胞化學(xué)和ELISA結(jié)果雖均較對照組有所增高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 3.sRAGE可拮抗HMGB1對HSC的激活作用：免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示,在sRAGE+HMGB1組,HSC細胞質(zhì)中α-SMA、TGF-β1表達水平較HMGB1組明顯減少(P0.05)；ELISA結(jié)果顯示,sRAGE+HMGBI組培養(yǎng)液中的HA、PIIIP、CIV和TGF-β1含量較HMGB1組顯著下降(P0.05),sRAGE+HMGBI組的免疫細胞化學(xué)和ELISA結(jié)果雖均較對照組有所增高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 4.AGE無阻斷HMGB1對HSC的激活作用：免疫組化結(jié)果顯示,在AGE+HMGB1組HSC細胞質(zhì)中的α-SMA、TGF-β1表達較HMGB1組比較有所增加,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；ELISA結(jié)果顯示,AGE+HMGB1組培養(yǎng)液中的HA、PIIIP、CIV和TGF-β1含量較HMGB1組比較有所增加,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。AGE+HMGBI組的免疫組化和ELISA結(jié)果與對照組比,表達水平均明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論： 1.HMGB1可促進α-SMA、TGF-β1在HSC細胞質(zhì)中的表達,增加HA、PIIIP、CIV和TGF-β1的分泌,在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用； 2.RAGE抗體和sRAGE能抑制HMGB1對HSC的激活作用,能減少α-SMA、TGF-β1在HSC細胞質(zhì)中的表達,降低HA、PIIIP、CIV和TGF-β1的分泌,在一定程度上緩解肝纖維化的發(fā)展；雖然AGE與HMGB1結(jié)合于同一受體,但AGE并不抑制HMGB1對HSC的激活。 以上結(jié)果為以HMGB1為靶點的肝纖維化和肝硬化治療提供了新的思路和實驗依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R575.2

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本文編號：2681612