【摘要】： 腫瘤壞死因alpha增加腸上皮細(xì)胞屏障通透性的機(jī)制研究 目的 腸黏膜屏障是機(jī)體最重要的免疫防御屏障，將機(jī)體與腸道內(nèi)的外源性物質(zhì)隔離開(kāi)來(lái)，避免病原微生物的侵襲和抗原分子的損傷。腸黏膜屏障包括腸上皮細(xì)胞屏障、免疫屏障和微生物屏障，腸上皮細(xì)胞屏障是最重要的一道屏障，是腸黏膜屏障具有選擇性通透的基礎(chǔ)。目前研究發(fā)現(xiàn)腸上皮細(xì)胞屏障通透性增高參與多種疾病的發(fā)生(如炎癥性腸病、敗血癥、燒傷、終末期肝病、重癥胰腺炎等)，并且在這些情況下，血清腫瘤壞死因子alpha(TNFα)明顯升高，與腸上皮細(xì)胞屏障的損害程度呈正相關(guān)，抗TNFα抗體可以恢復(fù)受損的腸上皮細(xì)胞屏障。因此認(rèn)為TNFα是增加腸上皮細(xì)胞屏障通透性的重要因素。 雖然目前已經(jīng)形成共識(shí)：TNFα可以增加腸上皮細(xì)胞屏障的通透性，但TNFα的具體作用機(jī)制和方式還存在爭(zhēng)議。早期認(rèn)為與TNFα引起的細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，近年來(lái)則傾向于TNFα引起腸上皮細(xì)胞屏障損傷是凋亡非依賴性的。另外TNFα引起腸上皮細(xì)胞屏障通透性增高的具體作用環(huán)節(jié)也不十分清楚，可能與蛋白激酶C(PKC)、核因子kB(NF-kappaB)、肌球蛋白輕鏈激酶(MLCK)、絲裂原活化的蛋白激酶(MAPK)等信號(hào)途徑有關(guān)。因此我們應(yīng)用Caco-2細(xì)胞株建立體外腸上皮細(xì)胞屏障模型，觀察TNFα對(duì)腸上皮細(xì)胞屏障通透性和腸上皮細(xì)胞間緊密連接的影響，并在此基礎(chǔ)上探討了TNFα對(duì)調(diào)控緊密連接裝配的蛋白酶活化受體-3／非典型蛋白激酶C／蛋白酶活化受體-6(Par-3／aPKC／Par-6)復(fù)合體的影響和可能信號(hào)通路，以明確病理?xiàng)l件下，TNFα增加腸上皮細(xì)胞屏障通透性的作用機(jī)制。 材料和方法 1、體外腸上皮細(xì)胞屏障模型的建立 應(yīng)用Caco-2細(xì)胞株建立體外腸上皮細(xì)胞屏障模型，并應(yīng)用跨上皮細(xì)胞電阻(TEER)和熒光黃透過(guò)率兩種指標(biāo)檢測(cè)腸上皮細(xì)胞屏障的形成情況。 2、TNFα對(duì)腸上皮細(xì)胞屏障通透性的影響 加入不同濃度的TNFα(10μ／L或100μg／L)作用24h或加入TNFα100pg／L作用不同時(shí)間(2、4、8、24h)，觀察加入TNFα前后Caco-2細(xì)胞屏障跨上皮細(xì)胞電阻的改變及TNFα對(duì)Caco-2細(xì)胞熒光黃透過(guò)率的影響。 3、TNFα對(duì)腸上皮細(xì)胞間緊密連接的影響 透射電鏡下觀察加入TNFα100μtg／L作用24h后，Caco-2細(xì)胞間緊密連接形態(tài)學(xué)的改變。 4、TNFα對(duì)腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白o(hù)ccludin定位和表達(dá)的影響 制備Caco-2細(xì)胞NP-40可溶性和NP-40不溶性蛋白框架，應(yīng)用蛋白印跡雜交(Western blot)技術(shù)，檢測(cè)加入不同濃度的TNFα(10μg／L或100μg／L)作用24h后，不同蛋白框架內(nèi)腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白o(hù)ccludin表達(dá)的變化情況。并應(yīng)用免疫熒光和實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)occludin蛋白的定位和mRNA表達(dá)的變化情況。 5、TNFα對(duì)腸上皮細(xì)胞Par-3表達(dá)和定位的影響 加入TNFα100μg／L作用不同時(shí)間(0、4、8、24h)后，應(yīng)用免疫熒光、Western blot和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)TNFα對(duì)腸上皮細(xì)胞Par-3表達(dá)和定位的影響。 6、TNFα對(duì)腸上皮細(xì)胞非典型蛋白激酶C亞型PKλ丸和PKCζ活性的影響 應(yīng)用抗PKCζ／λ(Thr410／403)磷酸化抗體檢測(cè)加入TNFα100μg／L作用不同時(shí)間(0、4、8、24h)后，PKCλ／ζ(活性的改變。 7、應(yīng)用免疫共沉淀的方法檢測(cè)Caco-2細(xì)胞內(nèi)與Pat-3結(jié)合的信號(hào)分子 應(yīng)用抗Par-3抗體沉淀Caco-2細(xì)胞裂解產(chǎn)物，然后應(yīng)用抗T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移因子(Tiaml)抗體對(duì)沉淀產(chǎn)物進(jìn)行蛋白印跡雜交，明確Par-3是否與Tiaml結(jié)合。 8、TNFα對(duì)腸上皮細(xì)胞T淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移因子表達(dá)和定位的影響 加入TNFα100μg／L作用不同時(shí)間(0、4、8、24h)后，應(yīng)用免疫熒光、免疫電鏡、Western blot和RT-PCR技術(shù)檢測(cè)TNFα對(duì)腸上皮細(xì)胞Tiaml表達(dá)和定位的影響。 9、TNFα對(duì)腸上皮細(xì)胞Racl活性的影響 應(yīng)用配體免疫沉淀法檢測(cè)加入TNFα100μg／L作用不同時(shí)間(0、4、8、24h)后，Racl活性的改變。 10、Tiaml在TNFα降低緊密連接蛋白o(hù)ccludin表達(dá)中的作用 應(yīng)用小核糖核酸干擾(siRNA)技術(shù)沉默Caco-2細(xì)胞內(nèi)Tiaml基因，觀察在Tiaml低表達(dá)的Caco-2細(xì)胞內(nèi)，TNFα對(duì)緊密連接蛋白o(hù)ccludin表達(dá)的影響。 結(jié)果 1、TNFα增加腸上皮細(xì)胞屏障的通透性 與對(duì)照組相比，10μg／L TNFα即可降低腸上皮細(xì)胞屏障的TEER(P＜0.0005)，增加熒光黃透過(guò)率(P＜0.0005)，100μg／L TNFα這種作用更加明顯(P＜0.0005)。在作用時(shí)間上，TNFα100μg／L作用4h后，TEER值即開(kāi)始下降(P＜0.0005)，熒光黃透過(guò)率開(kāi)始升高(P=0.001)，24h這種作用達(dá)到最強(qiáng)(P＜0.0005)。 2、TNFα破壞腸上皮細(xì)胞間的緊密連接 正常CaCo-2細(xì)胞，緊密連接結(jié)構(gòu)完整，呈致密的帶狀結(jié)構(gòu)。加入TNFα100μg／L作用24h后，緊密連接斷裂，細(xì)胞間隙增寬。 3、TNFα引起腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白o(hù)ccludin的定位異常 正常Caco-2細(xì)胞，occludin蛋白沿細(xì)胞膜分布；加入TNFα10μg／L作用24h后，occludin蛋白呈鋸齒狀分布，并且熒光信號(hào)減弱；加入TNFαt100μg／L作用24h后，鋸齒狀分布更加明顯，熒光信號(hào)進(jìn)一步減弱，并且在胞漿內(nèi)可見(jiàn)陽(yáng)性染色。 4、TNFα引起occludin蛋白磷酸化減少 與對(duì)照組比較，加入TNFα100μg／L作用24h后，NP-40不溶性蛋白框架內(nèi)occludin蛋白(即磷酸化occludin蛋白)的相對(duì)含量明顯減少(P=0.016)，而NP-40可溶性蛋白框架內(nèi)occludin蛋白(即非磷酸化occludin蛋白)的相對(duì)含量沒(méi)有變化(P=0.99)。 5、TNFα不影響occludin mRNA的表達(dá) 與對(duì)照組比較，不同濃度的TNFα或TNFα作用不同時(shí)間，，均不能引起occludin mRNA的明顯改變(P=0.85，P=0.99)。 6、TNFα不影響Par-3的表達(dá)和定位 正常Caco-2細(xì)胞，Par-3定位在細(xì)胞膜上，與緊密連接蛋白的定位一致，加入TNFα不能改變Par-3蛋白的定位。Western blot和RT-PCR結(jié)果提示加入TNFα后，Par-3蛋白和mRNA的相對(duì)含量與正常對(duì)照組比較沒(méi)有差別(P=0.99，P=0.86)。 7、TNFα下調(diào)PKCλ/ζ活性 與正常對(duì)照組相比，TNFα100μg/L作用8h后，PKCλ/ζ活性開(kāi)始下降(P=0.014)，24h達(dá)到最低(P=0.001)。 8、Par-3與Tiam1免疫共沉淀 應(yīng)用抗Tiam1抗體對(duì)Par-3預(yù)沉淀產(chǎn)物進(jìn)行蛋白印跡雜交后，發(fā)現(xiàn)在170kDa處出現(xiàn)特異性蛋白條帶，證明在Caco-2細(xì)胞內(nèi)，Par-3與Tiam1結(jié)合。 9、TNFα增加Tiam1表達(dá)，促進(jìn)Tiam1活化 在正常Caco-2細(xì)胞，Tiam1分布在胞漿內(nèi)，加入TNFα100μg/L作用24h后，Tiam1向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移。Western blot和RT-PCR結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，TNFα100μg/L作用24h后，Tiam1蛋白和mRNA的相對(duì)含量明顯升高(P=0.029，P=0.011)。 10、TNFα促進(jìn)Rac1的活化 與正常對(duì)照組比較，加入TNFα后，總Rac1的含量沒(méi)有明顯變化(P=0.99)。但活性Rac1(GTP-Rac1)的含量在TNFα100μg/L作用24h后明顯升高(P=0.002)。 11、Tiam1介導(dǎo)TNFα引起的緊密連接蛋白o(hù)ccludin磷酸化減少 在Tiam1正常表達(dá)的Caco-2細(xì)胞，TNFα可以引起occludin蛋白磷酸化的減少，而在Tiam1低表達(dá)的Caco-2細(xì)胞，TNFα的這種作用消失，兩者相比有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.001)。 1、TNFα增加腸上皮細(xì)胞屏障的通透性。 2、TNFα破壞腸上皮細(xì)胞間的緊密連接，這是其增加腸上皮細(xì)胞屏障細(xì)胞旁通透性的作用位點(diǎn)。 3、TNFα引起緊密連接蛋白o(hù)ccludin的異常分布，使緊密連接蛋白o(hù)ccludin磷酸化減少，但不影響未磷酸化的occludin蛋白表達(dá)。 4、TNFα不影響occludin mRNA的表達(dá)，提示TNFα對(duì)occludin的調(diào)節(jié)發(fā)生在蛋白水平，而不是轉(zhuǎn)錄水平。 5、TNFα不影響Par-3的表達(dá)和定位，但能使PKCλ／ζ的活性降低，提示TNFα對(duì)于調(diào)控緊密連接裝配的Par-3／aPKC／Par-6復(fù)合體的定位沒(méi)有影響，但能抑制Par-3／aPKC／Par-6復(fù)合體的功能。 6、Tiam1-Rac1是Par-3／aPKC／Par-6復(fù)合體的上游信號(hào)因子。 7、TNFα能夠增加Tiam1蛋白和mRNA水平的表達(dá)，促進(jìn)Tiam1和Rac1活化。 8、TNFα引起Caco-2細(xì)胞緊密連接蛋白o(hù)ccludin磷酸化減少需要Tiam1的參與。
【圖文】：

差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(尸<0.0005)。提示TNFa可以降低Caco一2細(xì)胞的TEER，并具有濃度依賴性(圖1左)。TNFa對(duì)Caco一2細(xì)胞TEER的影響還具有時(shí)間依賴性。在加入，I’ NFaloo拼叭作用Zh后，TEER值即有所下降 (115.5士0.6oc時(shí))，但與加入TNFa前比較沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(尸一0.85);4h開(kāi)始TEER值明顯下降(65.1士0.5。·emZ)，sh為(45.9士。，4Q·emZ)， 24h達(dá)到最低(28.05土o.gQ·emZ)，與加入州Fa前(128.4士1.oocmZ)比較

正常Caco一2細(xì)胞對(duì)熒光黃的透過(guò)率很低(2.23士0.8%)，加入TNFa后，從10林g幾開(kāi)始，熒光黃的透過(guò)率即有增加(13.26士1.4%)，與正常對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(尸<0.0005)，100林留L時(shí)更加明顯(20.55士3.7%)(p<0.0005)(圖2左)。將T’NFal00林g/L與Caco一2細(xì)胞作用不同時(shí)間后，caco一2細(xì)胞對(duì)熒光黃的透過(guò)率分別為Zh(2.08士0.4%)，4h(5.41士0.7%)，sh(13.1士2.0%)，24h(23.05士1.7%)。從4h開(kāi)始，Caco一2細(xì)胞對(duì)熒光黃的透過(guò)率開(kāi)始升高，與正常對(duì)照組(2.07士0.2%)比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(尸=0.001)，8h增高更加明顯(尸<0.0005)
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2007
【分類號(hào)】：R574

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 楊玫;周安國(guó);王之盛;;鋅對(duì)斷奶仔豬腸道屏障的影響[J];中國(guó)飼料;2008年21期

本文編號(hào)：2681548