【摘要】：肝臟巨噬細(xì)胞在肝臟纖維化發(fā)生發(fā)展的過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用。目前,表觀遺傳修飾機(jī)制越來越被認(rèn)為是調(diào)控巨噬細(xì)胞表型的關(guān)鍵因素,其在巨噬細(xì)胞DNA水平的調(diào)控作用引起了研究者們廣泛的關(guān)注。然而,有關(guān)肝纖維化中巨噬細(xì)胞DNA甲基化修飾參與其表型變化調(diào)控的具體機(jī)制尚不明確。本研究利用四氯化碳(carbon tetrachloride,CCL4)腹腔注射誘導(dǎo)四周構(gòu)建小鼠肝纖維化模型,后通過肝臟原位灌流的方法提取小鼠原代肝臟巨噬細(xì)胞,采用流式細(xì)胞分選的方法分離出肝臟巨噬細(xì)胞,利用簡化的亞硫酸氫鹽測序(Reduced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)分別對對照組小鼠和肝纖維化模型組小鼠肝臟巨噬細(xì)胞DNA進(jìn)行甲基化水平的分析。RRBS測序結(jié)果表明,相比于對照組小鼠巨噬細(xì)胞DNA,纖維化模型組小鼠巨噬細(xì)胞DNA甲基化水平顯著升高,并且本研究篩選出26個(gè)基因,其啟動(dòng)子區(qū)域存在多個(gè)CPG島。其中,在18號染色體上,77,843,840~77843968區(qū)段的5’-untranslated region(5’-UTR)區(qū),脯氨酸-絲氨酸-蘇氨酸磷酸酶相互作用蛋白2(Proline-serine-threonine phosphatase-interacting protein 2,PSTPIP2)高甲基化水平引起了我們的關(guān)注。為了鑒定對照組小鼠和肝纖維化小鼠中PSTPIP2的蛋白及mRNA的表達(dá)情況,通過Western blot和q-PCR分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組小鼠中PSTPIP2的蛋白及mRNA的表達(dá)水平明顯低于對照組小鼠。并且肝組織免疫熒光結(jié)果顯示模型組小鼠巨噬細(xì)胞中PSTPIP2的熒光亮度明顯減弱。為了探究PSTPIP2表達(dá)變化對肝纖維化小鼠的影響,本研究通過構(gòu)建重組腺相關(guān)病毒(Recombination Adeno-Associated Virus,rAAV)作為載體將PSTPIP2在肝臟進(jìn)行過表達(dá),后再進(jìn)行CCL4誘導(dǎo)四周。通過Western blot分析,α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha smooth muscle actin,α-SMA)及一型膠原(Type I collagen,COL1a)的蛋白表達(dá)相對于空病毒載體纖維化小鼠顯著減少,結(jié)果提示小鼠肝臟纖維化程度明顯減輕。此外,通過ELISA檢測小鼠血清中的促炎因子,其中包括腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)、白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素12(interleukin-12,IL-12)和單核細(xì)胞趨化蛋白1(Monocyte chemotactic protein 1,MCP-1);以及抗炎因子,其中包括白介素10(interleukin-10,IL-10)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-beta1,TGF-β1)及白介素13(interleukin-13,IL-13),結(jié)果表明在小鼠肝臟過表達(dá)PSTPIP2顯著降低促炎因子的表達(dá),及提高抗炎因子的表達(dá),尤其是IL-10的表達(dá)。以上結(jié)果均提示,PSTPIP2在小鼠肝纖維化發(fā)生發(fā)展及炎癥中起到非常重要的作用。機(jī)制上,本實(shí)驗(yàn)通過脂多糖(LPS)及干擾素(Interferon-γ,IFN-γ)共同誘導(dǎo)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞株建立M1型巨噬細(xì)胞以及利用白介素4(interleukin-4,IL-4)誘導(dǎo)RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞株建立M2型巨噬細(xì)胞,通過Western blot和q-PCR分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)PSTPIP2的DNA甲基化與甲基化轉(zhuǎn)移酶3a(DNA methyltransferase 3a,DNMT3a)及甲基化轉(zhuǎn)移酶3b(DNA methyltransferase 3b,DNMT3b)有關(guān),并且PSTPIP2通過互相結(jié)合作用抑制STAT1的磷酸化以及促進(jìn)STAT6的磷酸化來參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表型的變化。以上研究表明,PSTPIP2的甲基化可能加重肝纖維化,且其將肝臟巨噬細(xì)胞的甲基化和極化(表型變化)聯(lián)系在一起,并可能成為調(diào)控肝損傷和炎癥的一個(gè)平衡點(diǎn),從而調(diào)控肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。
【圖文】：

安徽醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文結(jié)果 CCL4 誘導(dǎo)肝纖維化小鼠模型的建立及鑒定本研究建立肝纖維化小鼠模型（10%CCL4 腹腔注射，0.001ml/g 注射劑量，注射兩次，共注射四周）。為了鑒定小鼠肝纖維化程度，應(yīng)用 HE 以及 Masson法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組小鼠存在明顯的肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞,血管周圍有大量的炎胞浸潤以及存在顯著膠原沉積的表現(xiàn)。應(yīng)用免疫組織化學(xué)法對小鼠肝臟組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組小鼠組織中 α-SMA 呈高表達(dá)，主要表達(dá)于細(xì)胞間質(zhì)中，黃色(圖 1)。

維化小鼠及對照組小鼠肝組織中 α-SMA 和 COL1a 蛋白 Total α-SMAand COL1a protein levels in liver tissue were. The results are shown as relative expression against controeatment. (n=6 in vehicle group, n=6 in CCL4-induced group##P<0.01 vs vehicle mice.用微板法對兩組小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組小鼠中 ALT,AST 表達(dá)水平明顯高于
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R575

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李靜;季菊玲;;肝臟巨噬細(xì)胞及其在肝損傷中的作用[J];世界華人消化雜志;2017年14期

2 李虹霞;劉伏山;王慶軍;牛海艷;;肝臟巨噬細(xì)胞及其在慢性肝損傷作用的研究[J];中國城鄉(xiāng)企業(yè)衛(wèi)生;2016年11期

3 劉夢琪;臧奕;李佳;;肝臟巨噬細(xì)胞在組織穩(wěn)態(tài)和肝臟疾病中的功能探討[J];藥學(xué)進(jìn)展;2018年10期

4 盧先明;張水軍;;肝臟巨噬細(xì)胞極化在肝臟缺血再灌注損傷中的作用及機(jī)制研究進(jìn)展[J];河南醫(yī)學(xué)研究;2019年11期

5 劉智勇;朱澤民;;肝臟巨噬細(xì)胞中維生素D受體的激活可以阻止小鼠肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激[J];臨床肝膽病雜志;2019年10期

6 蔡大川;;以肝臟巨噬細(xì)胞為靶點(diǎn)治療肝病[J];肝臟;2017年08期

7 馬衛(wèi)德;趙殿元;唐麗;;肝臟巨噬細(xì)胞的研究進(jìn)展[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2016年02期

8 邵小娟;陳東風(fēng);;肝臟巨噬細(xì)胞極化與非酒精性脂肪性肝病的關(guān)系[J];胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志;2013年03期

9 管必隆;李維信;;小白鼠肝臟巨噬細(xì)胞的發(fā)生和分化[J];解剖學(xué)報(bào);1965年04期

10 王燕紅;鄭書全;黃小莉;劉天會;王萍;劉濤;高山;郭良霞;尤紅;叢敏;;基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1對小鼠肝臟肝臟巨噬細(xì)胞募集作用的研究[J];臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2018年06期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前7條

1 楊揚(yáng);PSTPIP2的甲基化修飾調(diào)控肝臟巨噬細(xì)胞極化過程對四氯化碳誘導(dǎo)的肝纖維化和炎癥的作用研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2019年

2 陽喬;單核/巨噬細(xì)胞在肝衰竭中的作用及調(diào)節(jié)機(jī)制研究[D];浙江大學(xué);2013年

3 周曉棠;Tim-3參與調(diào)節(jié)NASH進(jìn)展過程中肝臟巨噬細(xì)胞的動(dòng)態(tài)演變[D];浙江大學(xué);2018年

4 王俊;MSCs促進(jìn)肝臟巨噬細(xì)胞向M2型極化治療急性肝衰竭的實(shí)驗(yàn)研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2016年

5 HAOYU SUN;肝臟巨噬細(xì)胞天然免疫膜受體的表達(dá)與肝癌的相關(guān)性研究[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2016年

6 楊帆;ConA誘導(dǎo)肝衰竭中肝臟巨噬細(xì)胞調(diào)控分子機(jī)制研究[D];浙江大學(xué);2015年

7 熊曉峰;新生小鼠肝臟巨噬細(xì)胞對NK細(xì)胞調(diào)控不足致膽道閉鎖的機(jī)理研究[D];華中科技大學(xué);2017年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前3條

1 郭麗萍;自身免疫性肝炎患者腸屏障功能及肝臟巨噬細(xì)胞極化分型的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2016年

2 賈艷杰;髓系細(xì)胞PTEN在肝再生過程中的作用機(jī)制探究[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2015年

3 李燕妮;自身免疫性肝炎患者腸屏障功能的變化及意義[D];天津醫(yī)科大學(xué);2017年

，

本文編號：2679354