【摘要】：[目的]檢測(cè) HSF2(Heat Shock Factor 2,HSF2)在不同 MES(Mayo endoscopic subscore,MES)評(píng)分的潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis,UC)患者糞便及腸粘膜中的水平。明確HSF2能否量化成為UC患者粘膜愈合的一個(gè)預(yù)測(cè)指標(biāo);探索HSF2在UC粘膜修復(fù)過程中的作用機(jī)制;重組表達(dá)HSF2蛋白,驗(yàn)證活性。旨在為預(yù)測(cè)UC黏膜愈合提供新的糞便指標(biāo),闡明HSF2在粘膜愈合中的作用機(jī)制,為制備HSF2抗體和ELISA試劑盒奠定基礎(chǔ)。[方法]本課題分為三個(gè)部分:第一部分:1.分別入組MES=0的患者12例,MES=1的患者15例,MES=2的患者14例,MES=3的患者10例,正常對(duì)照組10例,收集糞便及腸粘膜。ELISA檢測(cè)糞便HSF2和糞鈣衛(wèi)蛋白(Fecal Calprotectin,FC)含量,免疫組化檢查腸粘膜HSF2表達(dá)水平。進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析,分別比較糞便HSF2水平和MES評(píng)分,粘膜HSF2水平和MES評(píng)分,糞便HSF2和FC水平的相關(guān)性。2.納入隨訪的UC患者231例,收集患者清晨糞便,次日進(jìn)行腸鏡檢查并行MES評(píng)分。ELISA檢測(cè)糞便HSF2和FC水平,以腸鏡MES≤1為粘膜愈合評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),取HSF2 1.8 ng/ml為截?cái)嘀?作為粘膜愈合的預(yù)測(cè)指標(biāo),采用診斷試驗(yàn)評(píng)價(jià)方法,計(jì)算糞便HSF2水平在預(yù)測(cè)粘膜愈合中的特異性與靈敏性,陽性預(yù)測(cè)值與陰性預(yù)測(cè)值,繪制ROC曲線,并且與FC對(duì)比,評(píng)價(jià)糞便HSF2水平預(yù)測(cè)UC粘膜愈合的臨床價(jià)值。第二部分:1.甲潑尼龍治療DSS(Dextran sulfate sodium salt,DSS)化學(xué)性結(jié)腸炎小鼠(1)雄性SPF級(jí)C57BL/6小鼠60只,隨機(jī)分為正常對(duì)照組、DSS造模組、甲潑尼龍治療組和安慰劑組,15只/組。DSS造模組、甲潑尼龍治療組和安慰劑組自由飲用3%DSS溶液6天,治療組于第7天起給予甲潑尼龍溶液灌胃,安慰劑組于第7天起給予甲潑尼龍等體積的HPMC(hydroxypropylmethylcellulose,HPMC)溶液灌胃,共干預(yù)6天,期間正常對(duì)照組和DSS組自由飲用去離子水,于第13天處死小鼠獲取結(jié)腸標(biāo)本。(2)評(píng)估DAI、結(jié)腸損傷評(píng)分及結(jié)腸黏膜組織病理學(xué)評(píng)分。(3)PCR和免疫組化檢測(cè)各組結(jié)腸黏膜中HSF2及TGF-β的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平。2.RNA干擾和質(zhì)粒過表達(dá)干預(yù)HT-29細(xì)胞HSF2表達(dá),LPS刺激細(xì)胞,ELISA檢測(cè)細(xì)胞上清液IL-1β、TNF-α及TGG-β的含量,Western Blot檢測(cè)ERK、P38、JNK及Smad2/3的表達(dá)及磷酸化水平。第三部分:1.構(gòu)建pMAL-c2X-HSF2原核表達(dá)質(zhì)粒,鑒定正確后,采用IPTG誘導(dǎo)HSF-MBP融合蛋白表達(dá),直鏈淀粉柱純化重組蛋白,FactorXa因子切割去除MBP標(biāo)簽后考馬斯亮藍(lán)染色及Western Blot鑒定重組表達(dá)蛋白。2.凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)鑒定HSF2重組蛋白與熱休克轉(zhuǎn)錄元件HSE結(jié)合,將重組蛋白與HT-29細(xì)胞共培養(yǎng),PCR檢測(cè)HSF2轉(zhuǎn)錄因子下游HSP70 mRNA轉(zhuǎn)錄水平,驗(yàn)證重組蛋白生物活性。[結(jié)果]第一部分:1.糞便HSF2在正常對(duì)照組及MES=0,1,2,3的UC患者糞便中的含量分別為(0.64±0.09,1.30±0.35,1.84±0.46,2.38±0.57,3.38±0.42)ng/ml。FC 在正常對(duì)照組及MES=0,1,2,3的UC患者糞便中的含量分別為(31.90±11.89,181±113.31,490.53±171.12,916.85±371.77,1320.20±286.09)ug/g。與正常對(duì)照組相比,糞便HSF2和FC含量在MES=0,1,2,3的UC患者組中均有升高。上述結(jié)果組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。2.糞便HSF2和FC水平與MES評(píng)分均呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為(r=0.81,r=0.85)。糞便HSF2含量和FC含量也成正相關(guān),相關(guān)系數(shù)r=0.91。說明糞便HSF2水平具有量化為粘膜愈合預(yù)測(cè)指標(biāo)的潛質(zhì)。3.UC患者結(jié)腸粘膜免疫組化染色顯示HSF2表達(dá)于隱窩腺體細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞,在MES=0,1,2,3的UC患者腸粘膜內(nèi)HSF2陽性細(xì)胞比例分別為(25.35±5.20,41.83±13.54,54.21±16.54,66.98±16.96)%,隨著 MES 評(píng)分升高 HSF2 表達(dá)量增高,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.01)。腸粘膜HSF2表達(dá)水平與MES評(píng)分呈正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為r=0.74。4.以MES≤1為粘膜愈合的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),取HSF2 1.8 ng/ml,FC 181 ug/g為截?cái)嘀?作為預(yù)測(cè)粘膜愈合的指標(biāo),靈敏度分別為(67.8%,75%),特異度(80.9%,91.2%),陽性預(yù)測(cè)值為(67.1%,82.9%),陰性預(yù)測(cè)值為(81.5%,92.4%),糞便HSF2水平預(yù)測(cè)粘膜愈合的特異度和陰性預(yù)測(cè)值的臨床價(jià)值優(yōu)于敏感度和陽性預(yù)測(cè)值。5.糞便HSF2含量預(yù)測(cè)粘膜愈合曲線下面積AUC=0.919(95%[CI]:0.846-0.992,P0.0001),FC 含量預(yù)測(cè)粘膜愈合曲線下面積 AUC=0.958(95%[CI]:0.910-1.00,P0.0001),二者AUC均大于0.9,說明糞便HSF2水平預(yù)測(cè)粘膜愈合診斷試驗(yàn)具有較高的準(zhǔn)確性。第二部分:1.DSS造模后甲潑尼龍治療實(shí)驗(yàn),與正常對(duì)照組相比較,DSS造模組、甲潑尼龍治療組和安慰劑組的DAI、結(jié)腸損傷及組織病理評(píng)分明顯增加,其中治療組評(píng)分低于造模組與安慰劑組;小鼠腸粘膜PCR及免疫組化的結(jié)果顯示DSS造模后結(jié)腸黏膜HSF2與TGF-β轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平同步升高,甲潑尼龍治療后轉(zhuǎn)錄水平同步下降。2.與Negative Control對(duì)比,HSF2 siRNA干擾能顯著降低HT-29細(xì)胞HSF2表達(dá)水平,ERK、P38及JNK蛋白磷酸化水平增高,LPS誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞中上清液中IL-1β及TNF-α水平增高。相反的,與Blank Vetor對(duì)比,轉(zhuǎn)染HSF2-FLAG質(zhì)粒能明顯提高HT-29細(xì)胞HSF2表達(dá)水平,ERK、P38及JNK蛋白磷酸化水平降低,LPS誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞中上清液中IL-1β及TNF-α水平降低。3.與Negative Control對(duì)比,HSF2 siRNA干擾能顯著降低HT-29細(xì)胞HSF2表達(dá)水平,降低Smad2/3磷酸化水平,降低TGF-β水平。相反的,與B1aank Vetor對(duì)比,轉(zhuǎn)染HSF2-FLAG質(zhì)粒能明顯提高HT-29細(xì)胞HSF2表達(dá)水平,提高Smad2/3磷酸化水平,增加TGF-β水平。第三部分:1.成功構(gòu)建pMAL-c2X-HSF2原核表達(dá)質(zhì)粒,IPTG誘導(dǎo)后能大量表達(dá)可溶性HSF2重組蛋白,分離、純化及去除MBP標(biāo)簽后考馬斯亮藍(lán)染色及Western Blot鑒定重組蛋白分子量大小正確。2.EMSA實(shí)驗(yàn)證實(shí)HSF2重組蛋白能與HSE結(jié)合,重組蛋白與HT-29細(xì)胞共培養(yǎng)后,能增加HT-29細(xì)胞HSP70 mRNA轉(zhuǎn)錄水平,說明HSF2重組蛋白具有生物活性。[結(jié)論]1.糞便HSF2含量能作為預(yù)測(cè)UC粘膜愈合的一個(gè)潛在評(píng)價(jià)指標(biāo),具有較高的準(zhǔn)確性,其特異度和陰性預(yù)測(cè)值的臨床價(jià)值高于敏感度和陽性預(yù)測(cè)值。2.DSS誘導(dǎo)小鼠化學(xué)性結(jié)腸炎及治療后,腸粘膜HSF2與TGF-β轉(zhuǎn)錄水平同步升高和下降,提示HSF2可能調(diào)控TGF-β的表達(dá),促進(jìn)粘膜修復(fù)。3.HSF2通過抑制ERK、P38及JNK的磷酸化水平,減低LPS誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞炎性因子IL-1 β及TNF-α的水平;HSF2通過促進(jìn)Smad2/3磷酸化水平,提高HT-29細(xì)胞TGF-β的水平。提示HSF2能抑制炎癥反應(yīng)并促進(jìn)粘膜修復(fù)因子表達(dá),起到促進(jìn)粘膜修復(fù)的作用。4.成功重組表達(dá)、分離純化了具有生物活性的人源HSF2蛋白,為制備HSF2多克隆抗體和ELISA試劑盒,大規(guī)模檢測(cè)糞便HSF2水平奠定了良好的基礎(chǔ)。
【圖文】：

逡逑性分析。免疫組化染色顯示，ＨＳＦ２表達(dá)于隱窩腺體細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞（圖２），隨逡逑著ＭＥＳ評(píng)分升尚表達(dá)量增尚（表５），，而且各組間有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，Ｐ＜０．０１逡逑（圖３：邋Ａ）。腸粘膜ＨＳＦ２與ＭＥＳ評(píng)分呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為ｒ＝０．７４（圖３：邋Ｂ）。逡逑表５．腸粘膜ＨＳＦ２免疫組化陽性細(xì)胞數(shù)逡逑ＭＥＳ＝０邐ＭＥＳ＝１邐ＭＥＳ＝２邐ＭＥＳ＝３逡逑ＨＳＦ２邋Ｐｏｓｉｔｉｖｅ邐２５．３５邐４１．８３邐５４．２１邐６６．９８逡逑Ｃｅｌｌ邋（％）邐±５．２０邐±１３．５４邐±１６．５４邐±１６．９６逡逑＿ｉ逋A逡逑ｃｍｉ逡逑ｍｍ逡逑圖２．免疫組化檢測(cè)ＵＣ患者腸粘膜ＨＳＦ２表達(dá)。Ａ：邋ＭＥＳ＝０患者；Ｂ：邋ＭＥＳ＝１逡逑患者；Ｃ邋：邋ＭＥＳ＝２患者；Ｄ邋：邋ＭＥＳ＝３患者。逡逑２４逡逑

免疫組化染色顯示，ＨＳＦ２表達(dá)于隱窩腺體細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞（圖２），隨逡逑著ＭＥＳ評(píng)分升尚表達(dá)量增尚（表５），而且各組間有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，Ｐ＜０．０１逡逑（圖３：邋Ａ）。腸粘膜ＨＳＦ２與ＭＥＳ評(píng)分呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為ｒ＝０．７４（圖３：邋Ｂ）。逡逑表５．腸粘膜ＨＳＦ２免疫組化陽性細(xì)胞數(shù)逡逑ＭＥＳ＝０邐ＭＥＳ＝１邐ＭＥＳ＝２邐ＭＥＳ＝３逡逑ＨＳＦ２邋Ｐｏｓｉｔｉｖｅ邐２５．３５邐４１．８３邐５４．２１邐６６．９８逡逑Ｃｅｌｌ邋（％）邐±５．２０邐±１３．５４邐±１６．５４邐±１６．９６逡逑＿ｉ逋A逡逑ｃｍｉ逡逑ｍｍ逡逑圖２．免疫組化檢測(cè)ＵＣ患者腸粘膜ＨＳＦ２表達(dá)。Ａ：邋ＭＥＳ＝０患者；Ｂ：邋ＭＥＳ＝１逡逑患者；Ｃ邋：邋ＭＥＳ＝２患者；Ｄ邋：邋ＭＥＳ＝３患者。逡逑２４逡逑
【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R574.62

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2676166