【摘要】：一、研究背景和目的胃腸動力障礙存在于30%～50%糖尿病患者。平滑肌是胃腸運動的執(zhí)行者,其損傷必然導致胃腸動力障礙發(fā)生。但目前糖尿病結(jié)腸平滑肌病變的相關(guān)研究甚少。糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)參與了糖尿病的眾多并發(fā)癥,且存在于糖尿病大鼠結(jié)腸肌層組織,AGEs的標志物Nε-羧甲基賴氨酸(CML)通常用于衡量AGEs水平。糖尿病結(jié)腸平滑肌發(fā)生了何種病變,且AGEs是否參與平滑肌病變尚無研究報道。平滑肌細胞(SMC)標志性蛋白包括平滑肌肌球蛋白重鏈(SM MHC)、平滑肌肌動蛋白α (SM α-actin)、鈣調(diào)結(jié)合蛋白(caldesmon)等,這些蛋白是平滑肌收縮功能的基本裝置和調(diào)節(jié)蛋白。AGEs是否為可改變平滑肌收縮蛋白發(fā)生變化尚未闡明。因此,本研究首先從形態(tài)學上觀察糖尿病患者結(jié)腸平滑肌超微結(jié)構(gòu)改變；檢測肌層組織中AGEs含量以及平滑肌標志蛋白的表達變化,并將標志蛋白表達量與AGEs的含量進行相關(guān)性分析,明確糖尿病結(jié)腸平滑肌病變及其與AGEs的關(guān)系。進一步在動物試驗中,探討AGEs在糖尿病結(jié)腸平滑肌病變中的作用。SMC可在“收縮表型”及“合成表型”間相互轉(zhuǎn)換。正常胃腸道中SMC幾乎均以“收縮表型”存在。AGES起病變的分子機制,大多與氧化應激、JNK、 p-38 MAPK等相關(guān)；平滑肌標志蛋白的表達受Myocardin調(diào)控。在細胞實驗中,將通過建立體外培養(yǎng)“收縮型”SMC的模型,觀察AGEs影響“收縮型”SMC表達標志蛋白的作用及可能機制。二、方法1、糖尿病患者結(jié)腸平滑肌病變與糖基化終末產(chǎn)物相關(guān)性的臨床研究(1)收集2012年8月～2013年1月于江蘇省人民醫(yī)院行結(jié)腸手術(shù)患者(對照組及糖尿病組)的結(jié)腸標本,采集部位距離病變邊緣5cm以上(2) Western Blot法檢測糖尿病患者結(jié)腸肌層AGEs標志物CML含量(3)電鏡觀察糖尿病患者結(jié)腸平滑肌超微結(jié)構(gòu)改變(4) Western Blot法和Real-time PCR法檢測糖尿病患者結(jié)腸平滑肌標志蛋白及其mRNA表達變化(5) Pearson方法分析糖尿病患者結(jié)腸肌層AGEs標志物CML含量與平滑肌標志蛋白表達量的相關(guān)性2、糖基化終末產(chǎn)物在糖尿病大鼠結(jié)腸動力障礙平滑肌病變中的作用研究(1)采用鏈脲菌素(STZ)誘導的糖尿病(DM)大鼠模型,給與AG干預。實驗分組如下：①正常對照組(Control組)；②正常+AG組(Control+AG組)；③糖尿病組(DM組)；④糖尿病+AG組(DM+AG組)。(2)檢測并比較各組大鼠血清及結(jié)腸肌層AGEs標志物CML含量(3)檢測并比較各組大鼠結(jié)腸轉(zhuǎn)運時間及結(jié)腸肌條收縮功能(4)觀察并比較各組大鼠結(jié)腸大體標本情況及結(jié)腸肌層病理變化(HE染色)(5) Western Blot及Real-time PCR測定并比較各組大鼠結(jié)腸肌層平滑肌標志物表達變化。3、糖基化終末產(chǎn)物促平滑肌細胞標志蛋白表達的機制研究(1)改良培養(yǎng)方法建立體外培養(yǎng)“收縮型”SMC模型,并鑒定。(2)流式細胞術(shù)檢測AGEs對“收縮型”SMC細胞周期的影響。3) Western Blot及Real-time PCR檢測AGEs對“收縮型”SMC標志蛋白表達的濃度效應及時間效應。(4)流式細胞術(shù)檢測AGEs對“收縮型”SMC合成活性氧自由基(ROS)的作用。(5) Western Blot檢測JNK、p38 MAPK信號在AGEs促“收縮型”SMC標志蛋白表達中的作用。(6) siRNA干擾及熒光素酶報告基因的方法來觀察Myocardin在AGEs促“收縮型”SMC標志蛋白表達中的作用。三、結(jié)果1、糖尿病患者結(jié)腸平滑肌病變與糖基化終末產(chǎn)物相關(guān)性的臨床研究(1)對照組與糖尿病組各納入病例15例。糖尿病組與對照組相比,患者平均年齡與男女性別構(gòu)成比均無統(tǒng)計學差異。糖尿病組糖化血紅蛋白(HbAlc)水平顯著高于對照組。(2)糖尿病組結(jié)腸肌層中AGEs標志物CML水平顯著高于對照組。(3)糖尿病患者結(jié)腸平滑肌出現(xiàn)以下超微結(jié)構(gòu)改變：線粒體腫脹、空泡變性；SMC胞膜上致密斑、胞質(zhì)內(nèi)致密體數(shù)量增加；SMC細胞膜上腔洞數(shù)量明顯增加；縫隙連接損傷,連接中斷；但SMC間距離并未增寬,細胞間隙中也無過多的膠原纖維填充。(4)糖尿病患者結(jié)腸平滑肌標志蛋白SM MHC及SM α-actin mRNA水平較對照組升高；蛋白表達水平與mRNA趨勢一致。(5)糖尿病患者結(jié)腸肌層AGEs標志物CML含量與平滑肌標志蛋白SM MHC、 SM α-actin mRNA表達量均呈正相關(guān)。2、糖基化終末產(chǎn)物在糖尿病大鼠結(jié)腸動力障礙平滑肌病變中的作用研究(1)糖尿病大鼠模型成功建立,且AG干預不影響血糖水平。(2)DM組血清及結(jié)腸肌層AGEs標志物CML含量均顯著升高,DM+AG組CML含量低于DM組,與Control組無差異,且Control組與Control+AG組間CML含量無差異,說明AG可有效抑制AGEs (CML)形成。(3)DM組結(jié)腸轉(zhuǎn)運時間延長,肌肉收縮張力下降；DM+AG組結(jié)腸轉(zhuǎn)運時間短于DM組、肌肉收縮張力強于DM組,且均與Control組無差異；Control組與Control+AG組間結(jié)腸轉(zhuǎn)運時間和肌肉收縮張力無差異。(4)DM組結(jié)腸長度增加、肌層均勻增厚,SMC體積增大；DM+AG組未出現(xiàn)上述病理改變,與Control組無差異。Control組與Control+AG組間結(jié)腸長度、肌層厚度和SMC體積均無差異。(5)DM組結(jié)腸肌層平滑肌標志蛋白SM MHC及SM α-actin表達增加(蛋白及mRNA水平),DM+AG組SM MHC及SM α-actin表達低于DM組,與Control組無差異。Control組與Control+AG組間SM MHC及SM α-actin表達無差異。3、糖基化終末產(chǎn)物促平滑肌細胞標志蛋白表達的機制研究(1)將SMC接種于層粘連蛋白包被的培養(yǎng)皿中,用含低濃度血清(0.25%胎牛血清)和胰島素的培養(yǎng)基進行培養(yǎng),可維持SMC的收縮表型。(2) AGEs不改變“收縮型”SMC細胞周期,即不促進“收縮型”SMC增殖。(3) AGEs對“收縮型”SMC標志蛋白表達的作用成濃度、時間依賴性。(4) AGEs并不促進“收縮型”SMC合成ROS。(5) AGEs可激活JNK和p38 MAPK發(fā)生磷酸化,但只有p38 MAPK抑制劑(SB239063)可阻斷AGEs促“收縮型”SMC標志蛋白表達的作用,JNK(SP600125)不具備該作用。說明AGE促“收縮型”SMC標志蛋白表達的作用通過p38 MAPK完成。(6) ①AGEs促進“收縮型”SMC表達Myocardin, Myocardin siRNA可阻斷AGEs促SMC標志蛋白表達的作用。說明Myocardin參與AGEs促“收縮型”SMC標志蛋白表達的作用。②p38 MAPK抑制劑(SB239063)可阻斷：AGEs促“收縮型”SMC表達Myocardin的作用；AGEs增強Myocardin啟動子活性的作用。說明AGEs促進“收縮型”SMC表達Myocardin通過p38 MAPK完成。四、結(jié)論1、糖尿病患者結(jié)腸平滑肌存在與收縮相關(guān)的超微結(jié)構(gòu)改變,這可能是結(jié)腸動力障礙發(fā)生的基礎。糖尿病患者結(jié)腸肌層AGEs含量增加及結(jié)腸肌層平滑肌標志蛋白表達增加,且二者具有正相關(guān)性,因此AGEs可能參與糖尿病結(jié)腸平滑肌病變。2、糖尿病大鼠結(jié)腸轉(zhuǎn)運功能及肌肉收縮力下降,并伴有平滑肌細胞體積增大、標志蛋白表達增加的病理改變。AGEs是導致糖尿病大鼠結(jié)腸動力功能、肌肉收縮力下降及結(jié)腸平滑肌標志蛋白表達增加的上游因素。3、AGEs不引起“收縮型”SMC增殖,也不增加“收縮型”SMC ROS合成。AGEs促進“收縮型”SMC表達標志蛋白,該作用機制可能為激活p38 MAPK磷酸化,增強Myocardin啟動子活性,促進Myocardin表達,最終上調(diào)平滑肌標志蛋白表達水平。
【圖文】：

20 圖 1-1 糖尿病患者結(jié)腸肌層組織中 CML 含量ern Blot 檢測結(jié)腸肌層組織中 CML 含量；B. CML Western B量分析所得結(jié)果（**P＜0.01，，n=15）。

22 圖 1-2 糖尿病患者結(jié)腸 SMCs 超微結(jié)構(gòu)改變，B．結(jié)腸 SMC 內(nèi)線粒體（字母 m 所示處）及致密斑、致密板結(jié)構(gòu)（黑色箭頭所指處，D，E. 結(jié)腸 SMC 胞膜上腔洞結(jié)構(gòu)（符號*所示處）；F，G，H. 結(jié)腸 SMC 縫隙連接（黑色箭頭所指處）。
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R587.2;R574

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本文編號：2676120