發(fā)布時(shí)間：2020-05-21 15:10

【摘要】：(1)肝星狀細(xì)胞的激活是肝纖維化進(jìn)程的關(guān)鍵步驟,而TGF-β/Smads信號(hào)途徑對(duì)肝星狀細(xì)胞的激活尤為重要,Smad3是介導(dǎo)TGF-β信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)傳遞、活化肝星狀細(xì)胞的直接承擔(dān)者,在肝纖維化發(fā)展進(jìn)程中起著關(guān)鍵作用。本文以大鼠Smad3基因?yàn)檠芯繉?duì)象,第一步構(gòu)建并篩選出有效沉默大鼠Smad3基因的干擾載體。 (2)將有效沉默大鼠Smad3基因的干擾載體轉(zhuǎn)染入大鼠星狀細(xì)胞(hepatic setellate cells, HSC)HSC-T6中,下調(diào)表達(dá)Smad3基因,阻斷TGF-β/Smads信號(hào)途徑,通過(guò)體外試驗(yàn)觀察對(duì)大鼠HSC的激活的影響,判斷是否有抗纖維化。 (3)將有效沉默大鼠Smad3基因的干擾載體通過(guò)轉(zhuǎn)染入大鼠四氯化碳肝纖維化模型中,探討下調(diào)表達(dá)Smad3基因?qū)Υ笫笏穆然几卫w維化模型中肝纖維化指標(biāo)的影響,從而探索肝纖維化治療的新方法。 (4)利用本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的ppGalNAc-T2的siRNA表達(dá)載體,觀察ppGalNAc-T2下調(diào)后對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞TGFβ1-Smad3激活途徑相關(guān)基因表達(dá)的影響,從而初步探討糖基轉(zhuǎn)移酶ppGalNAc-T2對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞的TGFβ1-Smad3信號(hào)激活影響。 方法 (1)利用互聯(lián)網(wǎng)資源從基因庫(kù)中獲得Smad3基因序列,用ambion公司的siRNA設(shè)計(jì)工具,針對(duì)Smad3基因mRNA序列設(shè)計(jì)三條可能的小干擾RNA(siRNA),將這三條小干擾RNA插入到RNA干擾載體pRNAT-U6.1/Neo中構(gòu)建成三條干擾載體。將構(gòu)建的3個(gè)帶有熒光標(biāo)記的Smad3干擾載體(pRNAT-siSmad3-1、pRNAT-siSmad3-2、pRNAT-siSmad3-3)并分別轉(zhuǎn)染大鼠肝星狀細(xì)胞株(HSC)中,通過(guò)RT-PCR,Western-Blot的方法篩選出最有效的Smad3基因的siRNA表達(dá)載體。 (2)用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑將最有效的Smad3 siRNA表達(dá)載體(pRNAT-siSmad3-2)轉(zhuǎn)染入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大鼠HSC(1.0μg plasmid/106 cells)中,48小時(shí)后,用trizol提取總RNA,用RT-PCR檢測(cè)下調(diào)Smad3以后對(duì)HSC的Smad2,3,4及膠原I,III,IV mRNA表達(dá)的影響。 (3)80只成年SD大鼠隨機(jī)分成三組,對(duì)照組(30)模型組(30)治療組(20),模型組和治療組每周兩次皮下注射40%(v/v)四氯化碳橄欖油(3 ml/kg),共8周。從第四周起用陽(yáng)性脂質(zhì)體將siRNA表達(dá)載體質(zhì)粒(150μg/kg)在全麻,經(jīng)皮下注入模型組大鼠肝右葉中,每?jī)芍芤淮?而模型組注入相同體積的緩沖劑。于第6、8周末,取得肝組織及血清,觀察用纖維化半定量評(píng)分系統(tǒng)對(duì)病理切片的肝纖維化分級(jí),及血清相關(guān)指標(biāo)的影響。 (4)在大鼠肝星狀細(xì)胞中轉(zhuǎn)染ppGalNAc-T2的siRNA表達(dá)質(zhì)粒,用RT-PCR檢測(cè)TGFβ1- Smad3信號(hào)途徑相關(guān)基因mRNA的表達(dá)變化,Western blot以及免疫熒光方法檢測(cè)Smad3基因蛋白表達(dá)變化。 結(jié)果 (1)成功構(gòu)建到三個(gè)Smad3基因的有效siRNA干擾載體(pRNAT-siSmad3-1、pRNAT-siSmad3-2、pRNAT-siSmad3-3),并篩選出pRNAT-siSmad3-2為相對(duì)最佳的載體。 (2)轉(zhuǎn)染了pRNAT-siSmad3-2表達(dá)載體的肝星狀細(xì)胞中Smad3和膠原I,III,IV mRNA表達(dá)都受到了明顯抑制。 (3)治療組較模型組,病理切片用纖維化半定量評(píng)分系統(tǒng)觀察到肝纖維化分級(jí)有明顯減輕(P 0.05),血清肝纖維化指標(biāo)(III型前膠原,IV型膠原,層粘蛋白,透明質(zhì)酸)亦有明顯改善(P 0.01)。 (4)ppGalNAc-T2下調(diào)后肝星狀細(xì)胞中Smad2,Smad3,Smad4,膠原3α1(collagen type III, alpha 1 ,Col3α1),轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β調(diào)節(jié)基因4(transforming growth factor beta regulated gene 4, Tbrg4 ),轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growthfactor beta, TGFβ1),轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2(transforming growthfactor beta2, TGFβ2)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體3(transforming growth factor beta receptor3,Tgfβr3)的mRNA及Smad3的蛋白表達(dá)幾乎沒(méi)有變化(P㧐0.05),但轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體1(transforming growth factor, beta receptor 1,Tgfβr1)和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體2(transforming growth factor beta receptor2,Tgfβr2)都有較大程度的降低(P0.05) 結(jié)論 (1)轉(zhuǎn)染pRNAT-siSmad3-2載體后,下調(diào)Smad3的表達(dá),阻斷TGF-β/Smad3信號(hào)途徑,對(duì)大鼠HSC及四氯化碳肝纖維化模型有抗纖維化作用。 (2)RNAi下調(diào)Smad3的表達(dá)可以作為肝纖維化基因治療的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 (3)在大鼠肝星狀細(xì)胞中,ppGalNAc-T2下調(diào)對(duì)于TGFβ1-Smad3激活途徑基因表達(dá)基本沒(méi)有影響,其在肝星狀細(xì)胞中的具體功能有待于進(jìn)一步研究。
【圖文】：

圖 1-1 siRNA 表達(dá)載體 pRNAT-U6.1/Neo 結(jié)構(gòu)圖核苷酸的合成lenCircle RNAi Kit 說(shuō)明合成正義鏈和反義鏈 oligo，序列aaac tgtaaaaa ATCCGCATGAGCTTCGTCAAA gg tgt ttc gtc ctt tcc aac tgtaaaaa TTTGACGAAGCTCATGCGGAT gg tgt ttc gtc ctt tcc aaac tgtaaaaa TCTACCAGTTGACTCGCATGT gg tgt ttc gtc ctt tcc aac tgtaaaaa ACATGCGAGTCAACTGGTAGA gg tgt ttc gtc ctt tcc aaac tgtaaaaa GTCAAAGGCTGGGGAGCCGAG gg tgt ttc gtc ctt tcaaac tgtaaaaa CTCGGCTCCCCAGCCTTTGACgg tgt ttc gtc ctt tcc RNA 模板的退火 oligo分別用TE(pH8.0)溶解，濃度為100μM。取相應(yīng)的正按如下配置退火反應(yīng)體系：Components Volume (μl)

采用SPSS 13.0 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布資料用均數(shù)（x±s）標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用t檢驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次。雙側(cè)檢驗(yàn)P＜0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 結(jié)果2.1 Smad3干擾表達(dá)載體的測(cè)序結(jié)果每個(gè)載體組挑選兩個(gè)單克隆克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定（上海英駿生物技術(shù)有限公司），，測(cè)序結(jié)果正確。pRNAT-SiSmad3-2 的測(cè)序報(bào)告圖（圖 1-2）
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類(lèi)號(hào)】：R575.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2674488