發(fā)布時間：2020-05-21 15:10

【摘要】：(1)肝星狀細胞的激活是肝纖維化進程的關(guān)鍵步驟,而TGF-β/Smads信號途徑對肝星狀細胞的激活尤為重要,Smad3是介導TGF-β信號向細胞內(nèi)傳遞、活化肝星狀細胞的直接承擔者,在肝纖維化發(fā)展進程中起著關(guān)鍵作用。本文以大鼠Smad3基因為研究對象,第一步構(gòu)建并篩選出有效沉默大鼠Smad3基因的干擾載體。 (2)將有效沉默大鼠Smad3基因的干擾載體轉(zhuǎn)染入大鼠星狀細胞(hepatic setellate cells, HSC)HSC-T6中,下調(diào)表達Smad3基因,阻斷TGF-β/Smads信號途徑,通過體外試驗觀察對大鼠HSC的激活的影響,判斷是否有抗纖維化。 (3)將有效沉默大鼠Smad3基因的干擾載體通過轉(zhuǎn)染入大鼠四氯化碳肝纖維化模型中,探討下調(diào)表達Smad3基因?qū)Υ笫笏穆然几卫w維化模型中肝纖維化指標的影響,從而探索肝纖維化治療的新方法。 (4)利用本實驗室構(gòu)建的ppGalNAc-T2的siRNA表達載體,觀察ppGalNAc-T2下調(diào)后對大鼠肝星狀細胞TGFβ1-Smad3激活途徑相關(guān)基因表達的影響,從而初步探討糖基轉(zhuǎn)移酶ppGalNAc-T2對大鼠肝星狀細胞的TGFβ1-Smad3信號激活影響。 方法 (1)利用互聯(lián)網(wǎng)資源從基因庫中獲得Smad3基因序列,用ambion公司的siRNA設(shè)計工具,針對Smad3基因mRNA序列設(shè)計三條可能的小干擾RNA(siRNA),將這三條小干擾RNA插入到RNA干擾載體pRNAT-U6.1/Neo中構(gòu)建成三條干擾載體。將構(gòu)建的3個帶有熒光標記的Smad3干擾載體(pRNAT-siSmad3-1、pRNAT-siSmad3-2、pRNAT-siSmad3-3)并分別轉(zhuǎn)染大鼠肝星狀細胞株(HSC)中,通過RT-PCR,Western-Blot的方法篩選出最有效的Smad3基因的siRNA表達載體。 (2)用脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑將最有效的Smad3 siRNA表達載體(pRNAT-siSmad3-2)轉(zhuǎn)染入對數(shù)生長期的大鼠HSC(1.0μg plasmid/106 cells)中,48小時后,用trizol提取總RNA,用RT-PCR檢測下調(diào)Smad3以后對HSC的Smad2,3,4及膠原I,III,IV mRNA表達的影響。 (3)80只成年SD大鼠隨機分成三組,對照組(30)模型組(30)治療組(20),模型組和治療組每周兩次皮下注射40%(v/v)四氯化碳橄欖油(3 ml/kg),共8周。從第四周起用陽性脂質(zhì)體將siRNA表達載體質(zhì)粒(150μg/kg)在全麻,經(jīng)皮下注入模型組大鼠肝右葉中,每兩周一次,而模型組注入相同體積的緩沖劑。于第6、8周末,取得肝組織及血清,觀察用纖維化半定量評分系統(tǒng)對病理切片的肝纖維化分級,及血清相關(guān)指標的影響。 (4)在大鼠肝星狀細胞中轉(zhuǎn)染ppGalNAc-T2的siRNA表達質(zhì)粒,用RT-PCR檢測TGFβ1- Smad3信號途徑相關(guān)基因mRNA的表達變化,Western blot以及免疫熒光方法檢測Smad3基因蛋白表達變化。 結(jié)果 (1)成功構(gòu)建到三個Smad3基因的有效siRNA干擾載體(pRNAT-siSmad3-1、pRNAT-siSmad3-2、pRNAT-siSmad3-3),并篩選出pRNAT-siSmad3-2為相對最佳的載體。 (2)轉(zhuǎn)染了pRNAT-siSmad3-2表達載體的肝星狀細胞中Smad3和膠原I,III,IV mRNA表達都受到了明顯抑制。 (3)治療組較模型組,病理切片用纖維化半定量評分系統(tǒng)觀察到肝纖維化分級有明顯減輕(P 0.05),血清肝纖維化指標(III型前膠原,IV型膠原,層粘蛋白,透明質(zhì)酸)亦有明顯改善(P 0.01)。 (4)ppGalNAc-T2下調(diào)后肝星狀細胞中Smad2,Smad3,Smad4,膠原3α1(collagen type III, alpha 1 ,Col3α1),轉(zhuǎn)化生長因子β調(diào)節(jié)基因4(transforming growth factor beta regulated gene 4, Tbrg4 ),轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growthfactor beta, TGFβ1),轉(zhuǎn)化生長因子β2(transforming growthfactor beta2, TGFβ2)及轉(zhuǎn)化生長因子β受體3(transforming growth factor beta receptor3,Tgfβr3)的mRNA及Smad3的蛋白表達幾乎沒有變化(P㧐0.05),但轉(zhuǎn)化生長因子β受體1(transforming growth factor, beta receptor 1,Tgfβr1)和轉(zhuǎn)化生長因子β受體2(transforming growth factor beta receptor2,Tgfβr2)都有較大程度的降低(P0.05) 結(jié)論 (1)轉(zhuǎn)染pRNAT-siSmad3-2載體后,下調(diào)Smad3的表達,阻斷TGF-β/Smad3信號途徑,對大鼠HSC及四氯化碳肝纖維化模型有抗纖維化作用。 (2)RNAi下調(diào)Smad3的表達可以作為肝纖維化基因治療的實驗依據(jù)。 (3)在大鼠肝星狀細胞中,ppGalNAc-T2下調(diào)對于TGFβ1-Smad3激活途徑基因表達基本沒有影響,其在肝星狀細胞中的具體功能有待于進一步研究。
【圖文】：

圖 1-1 siRNA 表達載體 pRNAT-U6.1/Neo 結(jié)構(gòu)圖核苷酸的合成lenCircle RNAi Kit 說明合成正義鏈和反義鏈 oligo，序列aaac tgtaaaaa ATCCGCATGAGCTTCGTCAAA gg tgt ttc gtc ctt tcc aac tgtaaaaa TTTGACGAAGCTCATGCGGAT gg tgt ttc gtc ctt tcc aaac tgtaaaaa TCTACCAGTTGACTCGCATGT gg tgt ttc gtc ctt tcc aac tgtaaaaa ACATGCGAGTCAACTGGTAGA gg tgt ttc gtc ctt tcc aaac tgtaaaaa GTCAAAGGCTGGGGAGCCGAG gg tgt ttc gtc ctt tcaaac tgtaaaaa CTCGGCTCCCCAGCCTTTGACgg tgt ttc gtc ctt tcc RNA 模板的退火 oligo分別用TE(pH8.0)溶解，濃度為100μM。取相應的正按如下配置退火反應體系：Components Volume (μl)

采用SPSS 13.0 for Windows統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，正態(tài)分布資料用均數(shù)（x±s）標準差表示，統(tǒng)計學方法采用t檢驗，每個實驗均重復三次。雙側(cè)檢驗P＜0.05時，差異有統(tǒng)計學意義。2 結(jié)果2.1 Smad3干擾表達載體的測序結(jié)果每個載體組挑選兩個單克隆克隆進行測序鑒定（上海英駿生物技術(shù)有限公司），，測序結(jié)果正確。pRNAT-SiSmad3-2 的測序報告圖（圖 1-2）
【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R575.2

【參考文獻】

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1 朱睿,張開立,鄒向陽;RNA干擾(RNAi)技術(shù)及其在功能基因組學研究中的應用[J];大連醫(yī)科大學學報;2003年02期

2 陳峰;鄭敏;陳智;;Smad2和Smad3在TGF-β1信號轉(zhuǎn)導中的作用[J];國際流行病學傳染病學雜志;2006年03期

3 王連升,陳穎偉,李定國;TGFβ_1信號與肝纖維化[J];國外醫(yī)學(消化系疾病分冊);2004年03期

4 楊開選,程薇波,王文冬,沈圣;40%四氯化碳大鼠慢性肝損傷模型的研究[J];現(xiàn)代預防醫(yī)學;2005年01期

5 王泰齡,劉霞,周元平,何靜雯,張晶,李寧章,段鐘平,王寶恩;慢性肝炎炎癥活動度及纖維化程度計分方案[J];中華肝臟病雜志;1998年04期

6 張秉強,黃愛龍;RNA干擾及其在抗病毒治療方面的研究進展[J];中華微生物學和免疫學雜志;2003年03期

7 陶艷艷;劉成海;;TGF-β1刺激肝星狀細胞活化與肝纖維化的分子病理機制研究進展[J];中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志;2006年02期

8 ;Preparation and identification of anti-transforming growth factor β1 U1 small nuclear RNA chimeric ribozyme in vitro[J];World Journal of Gastroenterology;2003年03期

本文編號：2674488