【摘要】： 目的 肝硬化及終末期肝病患者通常存在不同程度的腦水腫,血氨的升高促進(jìn)了肝性腦病的發(fā)生。腦水腫使顱內(nèi)壓升高,二者的惡性循環(huán)使患者預(yù)后不佳。而目前,臨床對(duì)其治療非常有限。水通道蛋白(AQP)是膜水通道蛋白家族,為調(diào)節(jié)細(xì)胞水平衡的選擇性孔道,其中AQP-4在大腦中分布廣泛,它在腦內(nèi)的研究成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn),增加對(duì)其了解可能為臨床腦水腫的治療提供新的方案。本研究擬應(yīng)用肝硬化動(dòng)物模型,給予氨負(fù)荷,研究水通道蛋白-4mRNA及蛋白的表達(dá)與腦水腫的關(guān)系。 材料與方法 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為健康雄性(SD)大鼠,隨機(jī)分為4組:(1)正常組:不加外界干預(yù)因素;(2)正常氨負(fù)荷組:實(shí)驗(yàn)?zāi)┙o予氨負(fù)荷;(3)肝硬化組:腹腔注射四氯化碳橄欖油溶液制備肝硬化動(dòng)物模型,注藥時(shí)間為12周,實(shí)驗(yàn)?zāi)┎患油饨绺深A(yù)因素;(4)肝硬化氨負(fù)荷組:制備肝硬化模型,方法同肝硬化組,實(shí)驗(yàn)?zāi)┙o予氨負(fù)荷。 1、血氨的檢測(cè):各組大鼠在給予氨負(fù)荷前及氨負(fù)荷30分鐘后分別經(jīng)內(nèi)眥靜脈采血1ml,并在半小時(shí)內(nèi)應(yīng)用vitors AMON干片比色法測(cè)定血氨值。 2、血腦屏障通透性的檢測(cè):處死動(dòng)物前2小時(shí)尾靜脈注射伊文思藍(lán)溶液,取腦組織溶于甲酰胺,離心取上清液于波長(zhǎng)632nm進(jìn)行比色,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出腦組織EB含量,以此評(píng)價(jià)BBB通透性的變化。 3、腦水含量的檢測(cè):處死大鼠后,完整取出腦組織,干濕重法檢測(cè)腦水含量。 4、HE染色觀察肝、腦組織切片:2小時(shí)后處死大鼠,立即取大腦及肝右葉組織,應(yīng)用4%多聚甲醛固定。常規(guī)HE染色,顯微鏡下觀察肝臟和腦組織情況。 5、RT-PCR方法檢測(cè)AQP-4 mRNA表達(dá):總RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)、PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物電泳。 6、免疫組化法檢測(cè)腦組織AQP-4蛋白:取材、固定、組織塊脫水透明、石蠟包埋、切片、染色、封片。 7、所有數(shù)據(jù)均以(?)±s表示,應(yīng)用SPSS11.0軟件進(jìn)行方差分析,p值小于0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1、肝硬化氨負(fù)荷組中5只大鼠角膜反射與翻轉(zhuǎn)反射消失;正常組、正常氨負(fù)荷組及肝硬化組角膜反射與翻轉(zhuǎn)反射存在。肝硬化組4只大鼠有腹水生成,肝硬化氨負(fù)荷組6只大鼠有腹水生成。顯微鏡下觀察:肝硬化組及肝硬化氨負(fù)荷組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)破壞,纖維組織增生,有明顯硬化結(jié)節(jié)形成,而正常組及正常氨負(fù)荷組未見(jiàn)上述表現(xiàn)。四組大鼠腦組織大體標(biāo)本未見(jiàn)異常。 2、血氨檢測(cè)結(jié)果:給藥前,肝硬化及肝硬化氨負(fù)荷組大鼠與正常組及正常氨負(fù)荷組大鼠相比,血氨水平明顯升高,經(jīng)檢驗(yàn)P＜0.05;給藥后,肝硬化氨負(fù)荷組血氨進(jìn)一步升高,分別與其他三組相比,P＜0.05;肝硬化組血氨水平仍高于正常組及正常氨負(fù)荷組,經(jīng)檢驗(yàn)P＜0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;正常組與正常氨負(fù)荷組相比,P＞0.05,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 3、血腦屏障通透性及腦水含量檢測(cè)結(jié)果:肝硬化氨負(fù)荷組大鼠腦內(nèi)EB含量分別與正常組、正常氨負(fù)荷組及肝硬化組相比顯著增高,最高值達(dá)到1.9890 ug/g,經(jīng)檢驗(yàn)P＜0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;其他三組間經(jīng)比較,P＞0.05,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。肝硬化組及肝硬化氨負(fù)荷組大鼠腦內(nèi)水含量分別與正常組、正常氨負(fù)荷組相比明顯增高,P＜0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;肝硬化氨負(fù)荷組大鼠腦內(nèi)水含量與肝硬化組相比,P＜0.05,亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;正常組與正常氨負(fù)荷組相比,P＞0.05,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 4、AQP-4mRNA及蛋白表達(dá)檢測(cè)結(jié)果:肝硬化及肝硬化氨負(fù)荷組可見(jiàn)清晰電泳條帶,正常組及正常氨負(fù)荷組電泳條帶模糊不清。肝硬化及肝硬化氨負(fù)荷組大鼠腦組織AQP-4mRNA積分光密度(ID)的表達(dá)顯著高于正常組及正常氨負(fù)荷組,這兩組分別與正常組及正常氨負(fù)荷組相比,P＜0.05,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;肝硬化氨負(fù)荷組大鼠AQP-4mRNA積分光密度最高值達(dá)1.5100,高于肝硬化組,兩組相比P＜0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。正常組與正常氨負(fù)荷組相比,P＞0.05,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。四組大鼠腦組織免疫組化染色均可見(jiàn)AQP-4表達(dá)。肝硬化及肝硬化氨負(fù)荷組大鼠腦組織AQP-4較正常組及正常氨負(fù)荷組染色強(qiáng)度深,染色面積大。經(jīng)灰度值測(cè)定后可發(fā)現(xiàn):肝硬化及肝硬化氨負(fù)荷組灰度值明顯低于正常組及正常氨負(fù)荷組,肝硬化及肝硬化氨負(fù)荷組與正常組及正常氨負(fù)荷組相比,P＜0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;肝硬化氨負(fù)荷組大鼠灰度值低于肝硬化組,兩組相比P＜0.05,亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;正常組與正常氨負(fù)荷組相比,P＞0.05,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 結(jié)論 1、腹腔注射四氯化碳橄欖油溶液可制備肝硬化動(dòng)物模型。 2、肝硬化動(dòng)物模型存在氨代謝紊亂,給予高氨誘導(dǎo)后,血氨水平進(jìn)一步升高,提示血氨可能在肝性腦病的發(fā)生中起重要作用。 3、肝硬化動(dòng)物模型中,BBB通透性增加,腦水含量增加,AQP-4蛋白表達(dá)顯著升高,在肝硬化氨負(fù)荷組動(dòng)物模型中,三者表達(dá)同步升高,推測(cè)AQP-4可能參與了腦水腫發(fā)生發(fā)展過(guò)程。 4、肝硬化動(dòng)物模型中,AQP-4mRNA及蛋白表達(dá)均升高,推測(cè)AQP-4mRNA可能是調(diào)節(jié)AQP-4蛋白表達(dá)的機(jī)制之一。
【圖文】：

各組大鼠AQP一4平均灰度比較情況討論肝性腦病是肝臟解毒功能不全和肝衰竭的重要表現(xiàn)，發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，目前存在的學(xué)說(shuō)主要有:經(jīng)典的氨中毒、假性神經(jīng)遞質(zhì)、GABA、血漿氨基酸失衡學(xué)說(shuō)等，，其中氨中毒學(xué)說(shuō)仍占中心地位120]。血氨的升高對(duì)腦組織的損害表現(xiàn)在:干擾腦的能量代謝，使腦組織中的ATP生成減少，影響Na+一K+一ATP酶活性，破壞血腦屏障的完整性，干擾神經(jīng)遞質(zhì)間的平衡，使腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞水腫。本研究通過(guò)腹腔注射四氯化碳橄欖油溶液，制備肝硬化大鼠模型，給予高氨負(fù)荷，檢測(cè)不同條件下大鼠氨負(fù)荷前后血氨水平。結(jié)果表明:給藥前，肝硬化大鼠較正常大鼠血氨水平升高;給藥后，正常大鼠血氨無(wú)明顯變化，肝硬化大鼠血氨水平則明顯升高，且出現(xiàn)角膜反射及翻轉(zhuǎn)反射消失，提示肝硬化大鼠在未給氨之前，就已
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R575.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2674332