【摘要】： 第一部分病毒性肝炎后肝硬化組織中納米細(xì)菌的檢測、分離、鑒定與培養(yǎng) 目的:檢測病毒性肝炎后肝硬化組織中是否存在納米細(xì)菌,并對可能存在的納米細(xì)菌進(jìn)行分離、鑒定及培養(yǎng)。 方法:手術(shù)中獲取的12例病毒性肝炎后肝硬化組織及12例正常肝組織標(biāo)本,分別切取部分存于4%中性甲醛溶液中作石蠟包埋切片,以免疫組化法作納米細(xì)菌檢測。其余液氮速凍后存于—70℃冰箱,留作納米細(xì)菌的分離,納米細(xì)菌單克隆抗體間接免疫熒光法和電鏡檢測進(jìn)行鑒定。對分離的納米細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)過程中檢測電解質(zhì)及葡萄糖濃度的變化。 結(jié)果:12例病毒性肝炎后肝硬化組織中10例納米細(xì)菌檢測陽性,2例陰性,12例正常肝組織中1例納米細(xì)菌檢測陽性,11例陰性,肝硬化組織中納米細(xì)菌感染率高于正常肝組織(P＜0.05)。納米細(xì)菌單克隆抗體間接免疫熒光法檢測時,納米細(xì)菌可發(fā)出綠色熒光。透射電鏡下測量納米細(xì)菌直徑大小約為100～300nm。納米細(xì)菌培養(yǎng)過程中,K~+、Na~+、Cl~-、Mg~(2+)及葡萄糖的濃度無明顯變化(P＞0.05),而Ca~(2+)、P~(3-)濃度進(jìn)行性下降,每周檢測結(jié)果比較存在顯著性差異(P＜0.05)。 結(jié)論:病毒性肝炎后肝硬化組織中存在納米細(xì)菌。納米細(xì)菌單克隆抗體間接免疫熒光法快速準(zhǔn)確鑒定納米細(xì)菌,電鏡有助于納米細(xì)菌檢測。納米細(xì)菌培養(yǎng)生長過程中消耗Ca~(2+)、P~(3-),而不利用K~+、Na~+、Cl~-、Mg~(2+)及葡萄糖。 第二部分納米細(xì)菌對人正常肝細(xì)胞生物學(xué)形態(tài)的影響 目的:觀察納米細(xì)菌對人正常肝細(xì)胞生物學(xué)形態(tài)的變化及是否有損傷作用。 方法:光鏡下觀察不同濃度納米細(xì)菌作用于人正常肝細(xì)胞24小時和48小時后生物學(xué)形態(tài)的改變;MTT比色實驗和LDH釋放試驗檢測不同濃度納米細(xì)菌作用后人正常肝細(xì)胞存活和增殖情況,并檢測不同時間點NO的變化。 結(jié)果:不同濃度納米細(xì)菌作用后,光鏡下觀察人正常肝細(xì)胞形態(tài)存在不同程度改變,極低濃度時(OD=0.001,0.009)無明顯變化,隨濃度增加和作用時間延長,正常肝細(xì)胞外觀上逐漸出現(xiàn)細(xì)胞容量增加,腫脹,輪廓不清,細(xì)胞膜損傷破裂,甚至完全解體而無細(xì)胞結(jié)構(gòu)。不同濃度納米細(xì)菌作用48小時后:除OD=0.001組外,各濃度組MTT值低于對照組MTT值,存在顯著性差異(P＜0.05),各濃度組之間比較存在顯著性差異(P＜0.05)。作用72小時后:OD=0.137組和OD=0.246組的MTT值比較無顯著性差異(P＞0.05),其余各濃度組之間比較仍存在顯著性差異(P＜0.05)。比較不同時間點(48小時和72小時):OD=0.001,0.009時72小時的MTT值高于48小時的MTT值(P＜0.05)。OD=0.018,0.031,0.048,0.137時72小時的MTT值低于48小時的MTT值(P＜0.05)。OD=0.246時48小時的MTT值和72小時的MTT值比較無顯著性差異(P＞0.05)。不同濃度納米細(xì)菌作用于正常肝細(xì)胞時的LDH值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=712.064,P＜0.01),不同時間點的LDH值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=432.120,P＜0.01)。納米細(xì)菌濃度與作用時間之間存在交互效應(yīng)(F=217.308,P＜0.01)。與正常肝細(xì)胞組相比較,除OD=0.001組納米細(xì)菌與其差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.835)外,其余各組之間兩兩比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。隨著納米細(xì)菌濃度的逐步提高,各時間點LDH從細(xì)胞內(nèi)釋放的量逐漸升高,并與0小時比較存在顯著性差異(P＜0.05)。NO檢測:不同濃度納米細(xì)菌作用于人正常肝細(xì)胞時,除OD=0.001組與正常肝細(xì)胞對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義外(P=0.206),其余各組與對照組及不同濃度NB組兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。不同時間點兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。納米細(xì)菌濃度與作用時間之間有交互作用(F=625.454,P＜0.001)。 結(jié)論:納米細(xì)菌可以損傷人正常肝細(xì)胞,隨著濃度升高及作用時間延長,損傷程度越重,且在作用過程中產(chǎn)生NO,存在著濃度和時間依賴關(guān)系。 第三部分納米細(xì)菌損傷人正常肝細(xì)胞機制的初步探討 目的:探討納米細(xì)菌對人正常肝細(xì)胞的損傷機制。 方法:采用線粒體探針觀察不同濃度納米細(xì)菌作用人正常肝細(xì)胞時,在不同時間點線粒體通透性孔道的開放情況,并結(jié)合電鏡下線粒體超微結(jié)構(gòu)的改變,三磷酸腺苷檢測和流式細(xì)胞儀檢測。 結(jié)果:(1)OD=0.001納米細(xì)菌作用于正常肝細(xì)胞6小時后,即可以觀察到線粒體瞬時通透性孔道有一定程度的開放,部分線粒體跨膜電位出現(xiàn)下降。隨著作用時間的延長,更多的線粒體瞬時通透性孔道進(jìn)一步開放,至36小時,鈣黃綠素?zé)晒鈴姸冗M(jìn)一步減弱,MitoTracker CMXRos熒光由于線粒體的崩解,彌散分布于細(xì)胞內(nèi)。48小時,整個視野的鈣黃綠素?zé)晒鈴姸让黠@黯淡,MitoTrackerCMXRos熒光在細(xì)胞內(nèi)的分布顯得紊亂,無法分辨線粒體外形。結(jié)合同時間點電鏡圖片可以發(fā)現(xiàn)此時的線粒體出現(xiàn)明顯的嵴丟失及空泡化。至72小時,幾乎無鈣黃綠素?zé)晒?視野的底色顯示為熒光染料的殘跡,MitoTracker CMXRos熒光強度黯淡,分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)散在聚集,線粒體跨膜電位完全消失。整個過程中,細(xì)胞核仍然維持完整。OD=0.246納米細(xì)菌作用于正常肝細(xì)胞3小時即可觀察到PTP開放,6小時即可以看到鈣黃綠素?zé)晒饷黠@減弱,線粒體跨膜電位已經(jīng)開始出現(xiàn)下降。12小時,鈣黃綠素?zé)晒膺M(jìn)一步減弱,部分線粒體跨膜電位的降低及消失。14小時,線粒體已經(jīng)破裂,MitoTracker CMXRos熒光染料外溢至細(xì)胞質(zhì)內(nèi)。16小時,鈣黃綠素?zé)晒饣鞠?大部分線粒體的跨膜電位消失。24小時,僅僅殘留著鈣黃綠素?zé)晒馊玖霞癕itoTracker CMXRos染料痕跡,已無完整的細(xì)胞核及細(xì)胞形態(tài)。 (2)OD=0.001納米細(xì)菌作用于正常肝細(xì)胞36小時,電鏡下可以看到細(xì)胞內(nèi)大部分線粒體已經(jīng)廣泛空泡化,嵴丟失。在OD=0.246作用正常肝細(xì)胞12小時,電鏡下觀察到線粒體變得腫脹,嵴結(jié)構(gòu)紊亂,16小時則觀察到肝細(xì)胞線粒體均已經(jīng)空泡化,但是細(xì)胞核仍維持完整。 (3)OD=0.246組納米細(xì)菌攻擊正常肝細(xì)胞6小時引起凋亡。OD=0.001組納米細(xì)菌作用于正常肝細(xì)胞24小時,細(xì)胞凋亡。OD=0.018組納米細(xì)菌作用24小時僅僅出現(xiàn)一個較低的凋亡峰。 (4)三磷酸腺苷檢測:不同濃度的納米細(xì)菌作用人正常肝細(xì)胞時RLU值有統(tǒng)計學(xué)意義(F=7.808,P=0.013)。正常肝細(xì)胞組與OD=0.001,0.018組之間RLU值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.614,0.213),而與OD=0.048,0.137及0.246組之間均有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.034,0.004,0.004)。OD=0.137與0.246組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.970)。不同時間點之間RLU差異有統(tǒng)計學(xué)顯著意義(F=251.181,P＜0.001),除0.5小時與0小時(P=0.144),0.5小時與1小時之間(P=0.053),6小時與48小時(P=0.080),12小時與24小時之間(P=0.366)之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義外,余各時間點兩兩比較RLU值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。納米細(xì)菌濃度與攻擊時間有交互作用(F=142.551,P＜0.001)。 結(jié)論: 1.納米細(xì)菌對于人正常肝細(xì)胞的損傷是通過誘導(dǎo)線粒體瞬時通透性孔道的開放實現(xiàn)的。 2.納米細(xì)菌作用于人正常肝細(xì)胞會產(chǎn)生凋亡,隨著納米細(xì)菌濃度的升高及作用時間的延長,會從凋亡轉(zhuǎn)為壞死。在此過程中,線粒體瞬時通透性孔道的開放和三磷酸腺苷的消耗決定了細(xì)胞最終的命運是凋亡還是壞死。
【圖文】：

論性肝炎后肝硬化組織中納米細(xì)菌的發(fā)現(xiàn)、鑒定及意義納米細(xì)菌是革蘭氏陰性菌，蛋白細(xì)菌類，呈球狀或球桿狀，細(xì)胞壁厚，鞭毛，卜內(nèi)疏胺酶(隊別比別吐姍)陰性，體積極小，具有獨特的礦化能值7.4環(huán)境中和生理鈣濃度狀況下可以形成磷灰石外殼搜蓋在菌體周所謂生物膜，在高溫強酸等許多徽生物難以生存的條件下生存。納米細(xì)病性，通過分泌一些細(xì)胞毒素及細(xì)胞因子(如內(nèi)毒素、脂多糖、白細(xì)胞，引起被感染細(xì)胞死亡。研究表明納米細(xì)菌與多種疾病相關(guān)如泌尿系2-1習(xí)，肝膽系統(tǒng)疾病f’，l刀，腫瘤11‘切，艾滋病腳洲，動脈粥樣硬化12兌刀，口‘翔等。體外實驗表明納米細(xì)菌能夠結(jié)合哺乳動物細(xì)胞，通過內(nèi)吞作細(xì)胞內(nèi)，給哺乳動物靜脈注射納米細(xì)菌可以經(jīng)尿路排出，在大鼠可以管和腎乳頭上皮細(xì)胞凋亡和脫落1311。我們前期用胎牛血清分離培養(yǎng)的

方程檢驗卜31.642，產(chǎn)0.000，有統(tǒng)計學(xué)意義，比較納米細(xì)菌濃度和作用時間二者的標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)夕，說明納米細(xì)菌濃度(0.545)對細(xì)胞損傷的影響大于作用時間(0.352)。從圖27，28可以看到，OD二0.oo1NB納米細(xì)菌正常肝細(xì)胞時，LDH的變化不大。隨著納米細(xì)菌濃度的逐步提高，，各時間點LDH從細(xì)胞內(nèi)釋放的量逐漸升高，并與0小時比較存在顯著性差異(P<0.05)。此外，OD二0.246組NB在24小時達(dá)到曲線最高值，而在48小時即明顯下降
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號】：R512.6;R575.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

1 唐中華,吳唯,呂新生,喻梅英,徐錫萍;乳腺癌組織中納米細(xì)菌樣顆粒的電鏡觀察[J];醫(yī)學(xué)臨床研究;2002年05期

2 王學(xué)軍;楊竹林;文宇;魏紅;劉威;李永國;E.Olavi Kajander;;慢性肝病、原發(fā)性肝癌病人血清、肝組織納米細(xì)菌的檢測[J];中華肝膽外科雜志;2006年03期

3 王學(xué)軍,劉威,楊竹林,魏紅,文宇,李永國;部分健康成年人群血清中納米細(xì)菌感染的調(diào)查[J];中華流行病學(xué)雜志;2004年06期

4 文宇,李永國,楊竹林,王學(xué)軍,魏紅,劉威,譚愛玲,苗雄鷹,王群偉,黃生福,E.Olavi Kajander,Neva Ciftcioglu;膽囊結(jié)石患者血清、膽汁與膽囊黏膜中納米細(xì)菌的分布研究[J];中華外科雜志;2003年04期

5 王學(xué)軍,楊竹林,魏紅,劉威,文宇,李永國,E.Olavi Kajander;原發(fā)性肝癌患者血清、肝組織納米細(xì)菌的檢測[J];中華外科雜志;2004年17期

本文編號：2674038