【摘要】： 【背景】 乙肝病毒(Hepatitis B virus, HBV)相關(guān)性疾病仍然是當今威脅人類健康的主要疾病之一。全球大約有乙肝病毒攜帶者3.5-4億人。我國是乙肝的高發(fā)區(qū),乙肝病毒攜帶者有1.2億之多,約占我國人口的9%。5年期間,約10-20%慢性肝炎患者可發(fā)展成肝硬化。6%-15%肝硬化和慢性肝炎患者可發(fā)展成肝癌。發(fā)生肝癌后的5年存活率不到5%。而目前的重組干擾素及核苷類似物等抗病毒治療手段由于持久效應低下、副作用、耐藥等導致療效不夠滿意,乙肝病毒復雜的復制調(diào)控過程阻礙著研究人員去尋找有效的治療途徑。因此,在探討乙肝病毒復制的分子機制基礎上尋找有效的治療靶點是目前研究的熱點。 現(xiàn)有研究顯示:雖然影響HBV復制的因素很多,如病毒自身編碼蛋白、細胞周期、免疫調(diào)節(jié)因子等,但是HBV基因組的轉(zhuǎn)錄是病毒復制過程中最關(guān)鍵的步驟,目前對HBV基因組的轉(zhuǎn)錄調(diào)控尚缺乏整體認識。已有研究表明:一些肝細胞富集轉(zhuǎn)錄因子如HNF1、HNF3、HNF4和C/EBP等在HBV的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用,但這些發(fā)現(xiàn)并未完全揭示HBV轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機制。這就提示,可能存在未知的調(diào)控HBV復制的轉(zhuǎn)錄因子,以及這些已知和未知的轉(zhuǎn)錄因子之間可能存在著相互作用的網(wǎng)絡關(guān)系,共同調(diào)控著HBV轉(zhuǎn)錄與復制。因此,尋找新的調(diào)控HBV復制的轉(zhuǎn)錄因子并闡明它們的作用機制,對揭示HBV在體內(nèi)復制的分子機制和尋找新的抗病毒治療靶點具有重要意義。 【目的】 篩選調(diào)控乙肝病毒復制的新的轉(zhuǎn)錄因子,并探討這些轉(zhuǎn)錄因子在乙肝病毒復制中的作用及其機制,為進一步闡明HBV在體內(nèi)復制的分子機制提供有益的補充,并為尋找新的抗病毒治療靶點提供理論依據(jù)。 【方法】 1.采用轉(zhuǎn)錄因子活性譜芯片檢測乙肝病毒穩(wěn)定復制的肝癌細胞系HepG2.2.15及其親本細胞HepG2轉(zhuǎn)錄因子活性譜的變化,對照注釋文件,找出活性差異的轉(zhuǎn)錄因子。2.利用酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA方法)對芯片結(jié)果進行驗證;3.利用免疫細胞化學檢測轉(zhuǎn)錄因子FoxO3a亞細胞定位;4.用Western blot檢測細胞中的FoxO3a磷酸化水平;5.收集患者乙肝病毒氋復制和低復制肝組織,Western blot檢測組織中FoxO3a磷酸化水平,分析FoxO3a的活性和HBV復制之間的關(guān)系;6.構(gòu)建FoxO3a-siRNA表達載體,通過細胞轉(zhuǎn)染,下調(diào)HepG2.2.15細胞中FoxO3a的表達;7.通過實時熒光定量PCR檢測FoxO3a-siRNA對HepG2.2.15細胞中HBV DNA和mRNA水平的影響,ELISA檢測FoxO3a-siRNA對HbsAg和HbeAg蛋白水平的影響;8.克隆HBV啟動子/增強子不同截短體,構(gòu)建含HBV啟動子/增強子序列的熒光素酶報告基因載體;報告基因?qū)嶒灆z測FoxO3a對HBV的轉(zhuǎn)錄活性的影響;9.染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)方法驗證細胞內(nèi)FoxO3a與HBV啟動子或增強子的結(jié)合;10. EMSA實驗確定HBV啟動子/增強子中FoxO3a結(jié)合位點;11.通過MTT試驗檢測FoxO3a-siRNA對肝癌細胞體外增殖能力的影響;12.通過流式細胞術(shù)分析FoxO3a-siRNA對肝癌細胞細胞周期的影響,Western blot檢測FoxO3a-siRNA轉(zhuǎn)染的肝癌細胞系細胞周期相關(guān)蛋白的表達。 【結(jié)果】 1.在芯片注釋文件Matrix矩陣中查找轉(zhuǎn)錄因子活性譜芯片中表達差異點所對應的轉(zhuǎn)錄因子,共篩選出12個轉(zhuǎn)錄因子家族分子在乙肝病毒穩(wěn)定復制的肝癌細胞系HepG2.2.15和其親本細胞HepG2中活性差異明顯(1.5倍),其中,在HepG2.2.15細胞中活性上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子有:HNF(1,3,4),C/EBP,FoxO (1,3a,4),FOXI1,SF-1,GR,SRY,COUP-TF1;活性下調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子有AP1,AP2,SP(1,2,3,4),Egr(1,2,3);其中有5個家族分子尚未報道與HBV復制相關(guān),它們分別是FoxO (1,3a,4),Eg(r1,2,3),FOXI1,SRY,AP2;在這5個家族分子中,以FoxO(1,3a,4)家族和AP2家族活性差異最為明顯;2. ELISA結(jié)果顯示:與對照細胞HepG2相比,FoxO(1,3a,4)在HepG2.2.15細胞中活性明顯上調(diào);而AP2在HepG2.2.15細胞中活性明顯下調(diào),與芯片結(jié)果一致;3.免疫熒光細胞化學結(jié)果顯示,在HepG2細胞,FoxO3a主要定位細胞漿,而在HepG2.2.15細胞,FoxO3a主要定位細胞核; 4.Western blot結(jié)果顯示,FoxO3a的磷酸化蛋白水平在HepG2細胞明顯呈高表達,而在HepG2.2.15呈低表達,p0.05,具有統(tǒng)計學意義;5. Western blot檢測組織標本中FoxO3a的磷酸化蛋白水平,結(jié)果表明:在7例HBV高復制的肝組織中FoxO3a磷酸化水平顯著低于6例低復制肝組織;6.將FoxO3a-siRNA表達載體瞬時轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細胞,Western blot結(jié)果證實,FoxO3a-siRNA能顯著降低FoxO3a的表達;7.實時熒光定量PCR實驗結(jié)果顯示,FoxO3a-siRNA能顯著抑制HepG2.2.15細胞上清和細胞內(nèi)的HBV DNA的水平;8.實時熒光定量PCR實驗結(jié)果顯示FoxO3a-siRNA能顯著抑制HepG2.2.15細胞的HBV mRNA的水平;9.ELISA的結(jié)果表明:FoxO3a-siRNA能顯著抑制乙肝病毒HBsAg和HBeAg蛋白水平,并且具有時間依賴性; 10.通過生物信息學分析,我們發(fā)現(xiàn),在HBV的啟動子/增強子區(qū)域有4個潛在的FREs(FoxO3a的DNA結(jié)合序列:(G/C)(T/A) AA(C/T)AA),將其成功亞克隆入報告基因載體,雙熒光素報告基因結(jié)果表明:1)FoxO3a可以直接調(diào)控HBV的轉(zhuǎn)錄活性;2)FoxO3a調(diào)控HBV的轉(zhuǎn)錄活性的潛在FRE位于FRE1(HBV基因組955-1184的區(qū)域內(nèi)); 11.CHIP實驗進一步證實在HepG2.2.15細胞內(nèi)FoxO3a同樣可與HBV增強子的結(jié)合,結(jié)合區(qū)域同報告基因結(jié)果(HBV基因組955-1184的區(qū)域內(nèi));12.EMSA結(jié)果證實FoxO3a通過與HBV增強子Ⅰ序列1127-1134bp(5’-GTAAACAA-3’)位點結(jié)合,增加HBV增強子Ⅰ的活性; 13.流式細胞術(shù)檢測周期發(fā)現(xiàn),FoxO3a-siRNA導致HepG2.2.15細胞周期進展,Western blot結(jié)果表明,FoxO3a上調(diào)P27KIP1的表達,而下調(diào)cyclinD1和cyclinD2的表達。14.生長曲線實驗表明,FoxO3a-siRNA能促進肝癌細胞體外增殖能力。 【結(jié)論】 1.宿主細胞轉(zhuǎn)錄因子在乙肝病毒穩(wěn)定復制的肝癌細胞系和其親本細胞中存在活性差異,眾多已知和未知的轉(zhuǎn)錄因子可能參與乙肝病毒的復制; 2. FoxO3a在乙肝病毒感染的細胞和組織中活性增高;3. FoxO3a能促進乙肝病毒的體外復制;4. FoxO3a促進乙肝病毒復制的分子機制包括兩個方面:一是FoxO3a通過與HBV增強子Ⅰ區(qū)域1127 - 1134bp(5’-GTAAACAA-3’)位點的結(jié)合,增加HBV增強子Ⅰ的活性,促進HBV的轉(zhuǎn)錄;二是通過上調(diào)P27KIP1,下調(diào)cyclinD1和cyclinD2的表達導致細胞周期G1/S期阻滯,從而促進乙肝病毒的復制。
【圖文】：

第四軍醫(yī)大學博士學位論文合物，并被核心抗原多肽二聚體包裹成未成熟的核殼體。在核殼體內(nèi)的 HBVDNA 多聚酶催化下，以 3.5kb 前基因組 RNA 為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成負鏈 HBVDNA，然后再以負鏈 DNA 為模板合成正鏈 HBV DNA。最終形成子代的不完全雙鏈環(huán)狀 DNA。因此，HBV 基因組（尤其是 3.5kb 前基因組）轉(zhuǎn)錄的調(diào)控是病毒生活周期中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，對其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制的深入研究具有重要意義。

圖 3 HBV 啟動子和增強子（引自 Journal of Viral Hepatitis, 2002, 9, 323 331）因讀碼框相互重疊，所有轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件均隱 定位于表面抗原基因與 X 基因開放讀碼框，增強子Ⅰ位于 966－1308（nt）之間；Xt 區(qū)段，，X 啟動子調(diào)節(jié)編碼 HBxAg 的 0.9 k錄位于轉(zhuǎn)錄開始位點前 140nt。X 基因啟動疊。這個最小的啟動子象大多數(shù) HBV 啟動。它缺乏通常的 TATA-盒或 GC 豐富的序列泛結(jié)合的位點和肝特異性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位nh Ⅰ /X啟動子(X 啟動子與增強子 EnhⅠ 3’點存在于核苷酸 1000 至 1250 位的區(qū)域，
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R512.62

【共引文獻】

相關(guān)博士學位論文 前1條

1 張慶鎬;基因多態(tài)性與自身免疫性疾病的相關(guān)性研究[D];延邊大學;2007年

相關(guān)碩士學位論文 前1條

1 王晶;p66shcA基因?qū)C12細胞周期的影響[D];蘭州大學;2007年

本文編號：2673851