【摘要】： 【背景】 乙肝病毒(Hepatitis B virus, HBV)相關(guān)性疾病仍然是當(dāng)今威脅人類健康的主要疾病之一。全球大約有乙肝病毒攜帶者3.5-4億人。我國是乙肝的高發(fā)區(qū),乙肝病毒攜帶者有1.2億之多,約占我國人口的9%。5年期間,約10-20%慢性肝炎患者可發(fā)展成肝硬化。6%-15%肝硬化和慢性肝炎患者可發(fā)展成肝癌。發(fā)生肝癌后的5年存活率不到5%。而目前的重組干擾素及核苷類似物等抗病毒治療手段由于持久效應(yīng)低下、副作用、耐藥等導(dǎo)致療效不夠滿意,乙肝病毒復(fù)雜的復(fù)制調(diào)控過程阻礙著研究人員去尋找有效的治療途徑。因此,在探討乙肝病毒復(fù)制的分子機(jī)制基礎(chǔ)上尋找有效的治療靶點(diǎn)是目前研究的熱點(diǎn)。 現(xiàn)有研究顯示:雖然影響HBV復(fù)制的因素很多,如病毒自身編碼蛋白、細(xì)胞周期、免疫調(diào)節(jié)因子等,但是HBV基因組的轉(zhuǎn)錄是病毒復(fù)制過程中最關(guān)鍵的步驟,目前對HBV基因組的轉(zhuǎn)錄調(diào)控尚缺乏整體認(rèn)識。已有研究表明:一些肝細(xì)胞富集轉(zhuǎn)錄因子如HNF1、HNF3、HNF4和C/EBP等在HBV的轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用,但這些發(fā)現(xiàn)并未完全揭示HBV轉(zhuǎn)錄調(diào)控的機(jī)制。這就提示,可能存在未知的調(diào)控HBV復(fù)制的轉(zhuǎn)錄因子,以及這些已知和未知的轉(zhuǎn)錄因子之間可能存在著相互作用的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系,共同調(diào)控著HBV轉(zhuǎn)錄與復(fù)制。因此,尋找新的調(diào)控HBV復(fù)制的轉(zhuǎn)錄因子并闡明它們的作用機(jī)制,對揭示HBV在體內(nèi)復(fù)制的分子機(jī)制和尋找新的抗病毒治療靶點(diǎn)具有重要意義。 【目的】 篩選調(diào)控乙肝病毒復(fù)制的新的轉(zhuǎn)錄因子,并探討這些轉(zhuǎn)錄因子在乙肝病毒復(fù)制中的作用及其機(jī)制,為進(jìn)一步闡明HBV在體內(nèi)復(fù)制的分子機(jī)制提供有益的補(bǔ)充,并為尋找新的抗病毒治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。 【方法】 1.采用轉(zhuǎn)錄因子活性譜芯片檢測乙肝病毒穩(wěn)定復(fù)制的肝癌細(xì)胞系HepG2.2.15及其親本細(xì)胞HepG2轉(zhuǎn)錄因子活性譜的變化,對照注釋文件,找出活性差異的轉(zhuǎn)錄因子。2.利用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA方法)對芯片結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證;3.利用免疫細(xì)胞化學(xué)檢測轉(zhuǎn)錄因子FoxO3a亞細(xì)胞定位;4.用Western blot檢測細(xì)胞中的FoxO3a磷酸化水平;5.收集患者乙肝病毒氋復(fù)制和低復(fù)制肝組織,Western blot檢測組織中FoxO3a磷酸化水平,分析FoxO3a的活性和HBV復(fù)制之間的關(guān)系;6.構(gòu)建FoxO3a-siRNA表達(dá)載體,通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染,下調(diào)HepG2.2.15細(xì)胞中FoxO3a的表達(dá);7.通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測FoxO3a-siRNA對HepG2.2.15細(xì)胞中HBV DNA和mRNA水平的影響,ELISA檢測FoxO3a-siRNA對HbsAg和HbeAg蛋白水平的影響;8.克隆HBV啟動子/增強(qiáng)子不同截短體,構(gòu)建含HBV啟動子/增強(qiáng)子序列的熒光素酶報(bào)告基因載體;報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測FoxO3a對HBV的轉(zhuǎn)錄活性的影響;9.染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)方法驗(yàn)證細(xì)胞內(nèi)FoxO3a與HBV啟動子或增強(qiáng)子的結(jié)合;10. EMSA實(shí)驗(yàn)確定HBV啟動子/增強(qiáng)子中FoxO3a結(jié)合位點(diǎn);11.通過MTT試驗(yàn)檢測FoxO3a-siRNA對肝癌細(xì)胞體外增殖能力的影響;12.通過流式細(xì)胞術(shù)分析FoxO3a-siRNA對肝癌細(xì)胞細(xì)胞周期的影響,Western blot檢測FoxO3a-siRNA轉(zhuǎn)染的肝癌細(xì)胞系細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)。 【結(jié)果】 1.在芯片注釋文件Matrix矩陣中查找轉(zhuǎn)錄因子活性譜芯片中表達(dá)差異點(diǎn)所對應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子,共篩選出12個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族分子在乙肝病毒穩(wěn)定復(fù)制的肝癌細(xì)胞系HepG2.2.15和其親本細(xì)胞HepG2中活性差異明顯(1.5倍),其中,在HepG2.2.15細(xì)胞中活性上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子有:HNF(1,3,4),C/EBP,FoxO (1,3a,4),FOXI1,SF-1,GR,SRY,COUP-TF1;活性下調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子有AP1,AP2,SP(1,2,3,4),Egr(1,2,3);其中有5個(gè)家族分子尚未報(bào)道與HBV復(fù)制相關(guān),它們分別是FoxO (1,3a,4),Eg(r1,2,3),FOXI1,SRY,AP2;在這5個(gè)家族分子中,以FoxO(1,3a,4)家族和AP2家族活性差異最為明顯;2. ELISA結(jié)果顯示:與對照細(xì)胞HepG2相比,FoxO(1,3a,4)在HepG2.2.15細(xì)胞中活性明顯上調(diào);而AP2在HepG2.2.15細(xì)胞中活性明顯下調(diào),與芯片結(jié)果一致;3.免疫熒光細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示,在HepG2細(xì)胞,FoxO3a主要定位細(xì)胞漿,而在HepG2.2.15細(xì)胞,FoxO3a主要定位細(xì)胞核; 4.Western blot結(jié)果顯示,FoxO3a的磷酸化蛋白水平在HepG2細(xì)胞明顯呈高表達(dá),而在HepG2.2.15呈低表達(dá),p0.05,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;5. Western blot檢測組織標(biāo)本中FoxO3a的磷酸化蛋白水平,結(jié)果表明:在7例HBV高復(fù)制的肝組織中FoxO3a磷酸化水平顯著低于6例低復(fù)制肝組織;6.將FoxO3a-siRNA表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞,Western blot結(jié)果證實(shí),FoxO3a-siRNA能顯著降低FoxO3a的表達(dá);7.實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,FoxO3a-siRNA能顯著抑制HepG2.2.15細(xì)胞上清和細(xì)胞內(nèi)的HBV DNA的水平;8.實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示FoxO3a-siRNA能顯著抑制HepG2.2.15細(xì)胞的HBV mRNA的水平;9.ELISA的結(jié)果表明:FoxO3a-siRNA能顯著抑制乙肝病毒HBsAg和HBeAg蛋白水平,并且具有時(shí)間依賴性; 10.通過生物信息學(xué)分析,我們發(fā)現(xiàn),在HBV的啟動子/增強(qiáng)子區(qū)域有4個(gè)潛在的FREs(FoxO3a的DNA結(jié)合序列:(G/C)(T/A) AA(C/T)AA),將其成功亞克隆入報(bào)告基因載體,雙熒光素報(bào)告基因結(jié)果表明:1)FoxO3a可以直接調(diào)控HBV的轉(zhuǎn)錄活性;2)FoxO3a調(diào)控HBV的轉(zhuǎn)錄活性的潛在FRE位于FRE1(HBV基因組955-1184的區(qū)域內(nèi)); 11.CHIP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)在HepG2.2.15細(xì)胞內(nèi)FoxO3a同樣可與HBV增強(qiáng)子的結(jié)合,結(jié)合區(qū)域同報(bào)告基因結(jié)果(HBV基因組955-1184的區(qū)域內(nèi));12.EMSA結(jié)果證實(shí)FoxO3a通過與HBV增強(qiáng)子Ⅰ序列1127-1134bp(5’-GTAAACAA-3’)位點(diǎn)結(jié)合,增加HBV增強(qiáng)子Ⅰ的活性; 13.流式細(xì)胞術(shù)檢測周期發(fā)現(xiàn),FoxO3a-siRNA導(dǎo)致HepG2.2.15細(xì)胞周期進(jìn)展,Western blot結(jié)果表明,FoxO3a上調(diào)P27KIP1的表達(dá),而下調(diào)cyclinD1和cyclinD2的表達(dá)。14.生長曲線實(shí)驗(yàn)表明,FoxO3a-siRNA能促進(jìn)肝癌細(xì)胞體外增殖能力。 【結(jié)論】 1.宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子在乙肝病毒穩(wěn)定復(fù)制的肝癌細(xì)胞系和其親本細(xì)胞中存在活性差異,眾多已知和未知的轉(zhuǎn)錄因子可能參與乙肝病毒的復(fù)制; 2. FoxO3a在乙肝病毒感染的細(xì)胞和組織中活性增高;3. FoxO3a能促進(jìn)乙肝病毒的體外復(fù)制;4. FoxO3a促進(jìn)乙肝病毒復(fù)制的分子機(jī)制包括兩個(gè)方面:一是FoxO3a通過與HBV增強(qiáng)子Ⅰ區(qū)域1127 - 1134bp(5’-GTAAACAA-3’)位點(diǎn)的結(jié)合,增加HBV增強(qiáng)子Ⅰ的活性,促進(jìn)HBV的轉(zhuǎn)錄;二是通過上調(diào)P27KIP1,下調(diào)cyclinD1和cyclinD2的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞周期G1/S期阻滯,從而促進(jìn)乙肝病毒的復(fù)制。
【圖文】：

第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文合物，并被核心抗原多肽二聚體包裹成未成熟的核殼體。在核殼體內(nèi)的 HBVDNA 多聚酶催化下，以 3.5kb 前基因組 RNA 為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成負(fù)鏈 HBVDNA，然后再以負(fù)鏈 DNA 為模板合成正鏈 HBV DNA。最終形成子代的不完全雙鏈環(huán)狀 DNA。因此，HBV 基因組（尤其是 3.5kb 前基因組）轉(zhuǎn)錄的調(diào)控是病毒生活周期中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，對其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的深入研究具有重要意義。

圖 3 HBV 啟動子和增強(qiáng)子（引自 Journal of Viral Hepatitis, 2002, 9, 323 331）因讀碼框相互重疊，所有轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件均隱 定位于表面抗原基因與 X 基因開放讀碼框，增強(qiáng)子Ⅰ位于 966－1308（nt）之間；Xt 區(qū)段，，X 啟動子調(diào)節(jié)編碼 HBxAg 的 0.9 k錄位于轉(zhuǎn)錄開始位點(diǎn)前 140nt。X 基因啟動疊。這個(gè)最小的啟動子象大多數(shù) HBV 啟動。它缺乏通常的 TATA-盒或 GC 豐富的序列泛結(jié)合的位點(diǎn)和肝特異性轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位nh Ⅰ /X啟動子(X 啟動子與增強(qiáng)子 EnhⅠ 3’點(diǎn)存在于核苷酸 1000 至 1250 位的區(qū)域，
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R512.62

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 張慶鎬;基因多態(tài)性與自身免疫性疾病的相關(guān)性研究[D];延邊大學(xué);2007年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 王晶;p66shcA基因?qū)C12細(xì)胞周期的影響[D];蘭州大學(xué);2007年

本文編號：2673851