發(fā)布時間：2020-05-20 10:02

【摘要】：背景酒精肝(alcoholic liver disease,ALD)是由于長期大量飲酒導致的肝臟疾病。初期通常表現(xiàn)為脂肪肝,進而可發(fā)展為酒精性肝炎、肝纖維化和肝硬化,最終導致肝癌。酒精性肝病是一個全球性的公共衛(wèi)生問題,每年全球約有上百萬的ALD患者,具有很高的發(fā)病率及死亡率。Apelin作為一種重要的生物活性肽,是G蛋白偶聯(lián)受體APJ的內源性配體,可以通過內分泌、旁分泌、自分泌的方式激活其受體APJ并與其結合,從而發(fā)揮病理學和生理學方面的作用。目前,有關apelin/APJ在肝臟疾病中的作用仍在探索中,apelin在酒精性肝病中的研究至今鮮有報道,最近有關文獻表明在肝臟發(fā)生炎性損傷后,apelin的表達量明顯增加,由此探索apelin在酒精性肝臟中的表達情況以及它與酒精性肝病發(fā)生發(fā)展的關系逐漸成為一個新的研究熱點。目的本實驗研究的目的是探討在酒精性肝病中apelin與炎癥因子之間的相互作用及影響;驗證apelin是否促進酒精性肝病中炎癥因子的表達,以及探索apelin促進肝臟炎癥的機制。方法1.將RAW264.7細胞接種于培養(yǎng)板中,按實驗分組分為酒精量效關系組:(1)對照組;(2)0.05μmol/L;(3)0.1μmol/L;(4)0.2μmol/L;處理時間為24 h;酒精時效關系組:(1)0 h;(2)6 h;(3)12 h;(4)24 h;處理濃度為0.1μmol/L,qRT-PCR檢測apelin以及炎癥因子轉錄水平的變化,通過油紅染色觀察細胞內脂質積聚情況。2.在RAW264.7細胞中加入不同濃度以及不同時間點的apelin-13處理24 h后,通過Western blot及qRT-PCR檢測炎癥因子水平的變化。3.在RAW264.7細胞中加入酒精(0.1μmol/L)孵育24 h后加入不同濃度以及不同時間點的apelin-13處理24 h,通過Western blot及qRT-PCR檢測炎癥因子水平的變化。4.將RAW264.7細胞分為空載組,空載(1.6μg)+酒精(0.1μmol/L)組,過表達apelin組(1.6μg),apelin+酒精(0.1μmol/L)組,轉染24 h后按實驗分組分別加酒精處理24 h后,通過Western blot及qRT-PCR檢測炎癥因子水平的變化,進行鬼筆環(huán)肽染色觀察細胞微絲熒光表達的變化。5.將RAW264.7細胞分為si-con組,si-con+酒精(0.1μmol/L)組,si-apelin組,si-apelin+酒精(0.1μmol/L)組,轉染24 h后按實驗分組分別加酒精處理24 h后,通過Western blot及qRT-PCR檢測炎癥因子水平的變化,進行鬼筆環(huán)肽染色觀察細胞微絲熒光表達的變化。6.構建酒精性肝病模型:選取6~8周C57BL/6雄性小鼠,19~23 g,適應性喂養(yǎng)一周后用于實驗,將野生雄性小鼠隨機分為3組:正常對照組;酒精處理組;apelin聯(lián)合酒精組。喂養(yǎng)10周后處死,部分肝組織用4%中性甲醛溶液固定保存其余肝組織于液氮中速凍,再移至-80℃冰箱長期保存。7.提取小鼠肝臟蛋白,Western blot檢測小鼠體內炎癥因子的表達情況;免疫組織化學技術檢測小鼠肝內炎癥因子的表達情況;將小鼠肝臟組織經超聲破碎勻漿后提取總RNA,qRT-PCR檢測肝臟組織炎癥相關因子轉錄水平的變化;酒精肝小鼠肝臟組織經過處理后做HE染色,從形態(tài)學方面觀察小鼠肝臟損傷程度;通過油紅染色觀察小鼠肝組織內脂質積聚情況。結果1.在RAW264.7細胞中,給予不同濃度以及不同時間點的酒精刺激,qRT-PCR結果表明apelin、APJ以及炎癥因子IL-6、IL-1β、趨化蛋白MCP-1基因的轉錄水平隨酒精時間和劑量依賴性升高。2.油紅染色檢測RAW264.7細胞內脂質積聚隨著酒精時間點以及濃度點梯度增加。3.在RAW264.7細胞中,單獨加入不同濃度以及不同時間點的apelin-13處理后,apelin-13能濃度依賴及時間依賴性促進炎癥因子IL-6,IL-1β以及趨化蛋白MCP-1,PCNA的蛋白水平及轉錄水平表達升高。4.在RAW264.7細胞中,先加入酒精孵育24 h后再給與不同濃度以及不同時間點的apelin-13刺激,造成炎癥因子及趨化蛋白MCP-1,PCNA表達量的升高。5.在RAW264.7細胞中,Western blot及qRT-PCR結果顯示,過表達apelin組與空載組相比,炎癥因子IL-6、IL-1β以及趨化蛋白MCP-1,PCNA表達量均升高;apelin聯(lián)合酒精(0.1μmol/L)組炎癥因子IL-6、IL-1β以及趨化蛋白MCP-1,PCNA表達量上調最為明顯。6.鬼筆環(huán)肽染色結果顯示過表達apelin組及apelin聯(lián)合酒精(0.1μmol/L)組較空載組及apelin組細胞內微絲熒光顯色更強。7.在RAW264.7細胞中,通過Western blot及qRT-PCR結果表明敲低apelin組較正常組炎癥因子IL-6、IL-1β以及趨化蛋白MCP-1,PCNA表達量明顯降低。8.鬼筆環(huán)肽染色顯示在RAW264.7細胞中敲低apelin會使細胞內微絲的熒光強度明顯減弱。9.Apelin通過RAW264.7細胞中的ERK信號傳導促進肝臟炎癥的產生。10.動物實驗中,經HE染色結果可知,酒精刺激可使肝細胞變性壞死,apelin與酒精聯(lián)合處理組可見肝細胞廣泛壞死,炎性細胞浸潤明顯。油紅染色顯示,酒精刺激會使肝細胞脂肪變性,apelin處理能夠明顯增加肝細胞內脂質積聚。11.免疫組化結果顯示酒精組較正常組相比,apelin、MCP-1、PCNA的棕色顆粒明顯增多,apelin與酒精聯(lián)合處理組棕色顆粒最多,其結果與Western blot結果相一致。12.動物實驗中,qRT-PCR結果顯示apelin與酒精聯(lián)合處理組相較于酒精組的炎癥因子以及趨化蛋白MCP-1的轉錄水平表達量明顯升高。13.動物實驗中,Western blot結果顯示酒精性肝病小鼠肝組織中apelin與酒精聯(lián)合處理組相較于酒精組的MCP-1、PCNA、apelin蛋白的表達量明顯升高。結論1.在RAW264.7細胞中Apelin通過激活ERK信號通路促進肝臟炎癥的產生。2.在小鼠酒精性肝病模型中,apelin可以加重肝細胞脂肪變性,促進炎癥的產生。
【圖文】：

qRT-PCR 結果發(fā)現(xiàn)圖 3-1-A 和圖 3-1-B 中在加入酒精刺激后 apelin、APJ 基因的表達水平也隨著酒精的時間點和濃度點遞增，結果表明酒精可以促使炎癥的產生和發(fā)展，同時還會使 apelin、APJ 基因表達增加，由此我們認為 apelin 與炎癥的發(fā)生發(fā)展存在著一定的關聯(lián)。

qRT-PCR 結果發(fā)現(xiàn)圖 3-1-A 和圖 3-1-B 中在加入酒精刺激后 apelin、APJ 基因的表達水平也隨著酒精的時間點和濃度點遞增，結果表明酒精可以促使炎癥的產生和發(fā)展，同時還會使 apelin、APJ 基因表達增加，由此我們認為 apelin 與炎癥的發(fā)生發(fā)展存在著一定的關聯(lián)。
【學位授予單位】：河南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R575

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 陳詞;;虞朝輝：酒精性肝病[J];肝博士;2019年05期

2 劉發(fā)鵬;;美國科學家利用噬菌體療法治愈小鼠酒精性肝病[J];科技中國;2019年12期

3 曹海霞;范建高;;酒精性肝病合并非酒精性脂肪性肝病和肥胖[J];臨床肝膽病雜志;2019年03期

4 梁瀚文;;酒精性肝病的治療現(xiàn)狀分析[J];現(xiàn)代商貿工業(yè);2019年13期

5 陳吉虎;楊錦;;酒精性肝病的中西醫(yī)結合治療[J];內蒙古中醫(yī)藥;2019年07期

6 鮑旭;;酒精性肝病的治療進展[J];基層醫(yī)學論壇;2019年32期

7 彭珂;劉光偉;;劉光偉教授治療酒精性肝病經驗介紹[J];中國醫(yī)藥科學;2019年17期

8 王學文;白燕;;小柴胡湯加減治療肝膽濕熱型酒精性肝病[J];內蒙古中醫(yī)藥;2017年19期

9 肖達民;李丹青;吳艷華;;酒精性肝病的中醫(yī)臨床研究進展[J];中藥新藥與臨床藥理;2018年01期

10 龐玉花;王金環(huán);丁瑞花;蒲光蘭;;彩色多普勒超聲技術在酒精性肝病診斷中的應用價值[J];青海醫(yī)藥雜志;2017年11期

相關會議論文 前10條

1 王紅燕;余治健;鄧啟文;;一例重癥酒精性肝病患者的管理及文獻復習[A];第九屆全國疑難及重癥肝病大會論文集[C];2017年

2 劉勛臣;;86例酒精性肝病臨床分析[A];新世紀 新機遇 新挑戰(zhàn)——知識創(chuàng)新和高新技術產業(yè)發(fā)展（下冊）[C];2001年

3 厲有名;;我國酒精性肝病的研究現(xiàn)狀[A];新世紀 新機遇 新挑戰(zhàn)——知識創(chuàng)新和高新技術產業(yè)發(fā)展（下冊）[C];2001年

4 李亞;;中西藥結合治療酒精性肝病的臨床觀察[A];第十八次全國中西醫(yī)結合肝病學術會議論文匯編[C];2009年

5 崔雷;洪陽;周力;;酒精性肝病的診療進展[A];2009年貴州省中西醫(yī)結合消化系病學術交流暨專題學術講座論文匯編[C];2009年

6 姚樹坤;;酒精性肝病的中西醫(yī)結合治療[A];第二十三屆全國中西醫(yī)結合消化系統(tǒng)疾病學術會議暨消化疾病診治進展學習班論文匯編[C];2011年

7 姚樹坤;;酒精性肝病的中西醫(yī)結合治療[A];全國中西醫(yī)結合發(fā)展戰(zhàn)略研討會暨中國中西醫(yī)結合學會成立三十周年紀念會論文匯編[C];2011年

8 徐有青;;酒精性肝病的進展[A];首屆江西省中西醫(yī)結合肝病學術研討會、首屆江西省中西醫(yī)結合肝病新進展學習班資料匯編[C];2008年

9 邱萍;潘蘇華;;酒精性肝病的發(fā)病機制的研究進展[A];全國中藥藥理學會聯(lián)合會學術交流大會論文摘要匯編[C];2012年

10 茹清靜;;酒精性肝病:危害與防治[A];全國第4屆中西醫(yī)結合傳染病學術會議論文匯編[C];2012年

相關重要報紙文章 前10條

1 上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院肝硬化科/上海市中醫(yī)藥研究院肝病研究所 博士 副主任醫(yī)師 碩士生導師 彭景華;酒精性肝病，離我有多遠[N];上海中醫(yī)藥報;2019年

2 通訊員 靳芳卉 記者 江東洲 劉昊;新研究找到酒精性肝病潛在療法[N];科技日報;2019年

3 汪興明;酒精性肝病治療中藥新選擇[N];中國中醫(yī)藥報;2018年

4 本報記者 楊六香;“全國愛肝日” 關注酒精性肝病[N];中國醫(yī)藥報;2017年

5 金燕 陜西省人民醫(yī)院消化內一科;酒精性肝病戒酒是關鍵[N];保健時報;2015年

6 記者 孟凡明;酒精性肝病研究基地在長揭牌[N];吉林日報;2011年

7 李煥榮;脂肪肝的防治[N];中國醫(yī)藥報;2002年

8 齊念慈;肝臟“天敵”知多少[N];中國中醫(yī)藥報;2004年

9 黃顯斌 譚文強;當心喝酒喝出肝病[N];科技日報;2005年

10 葉建平;我國酒精性肝病發(fā)病率上升[N];中國中醫(yī)藥報;2008年

相關博士學位論文 前10條

1 陳衛(wèi)星;酒精性肝病的分子流行病學調查和發(fā)病機理的研究[D];浙江大學;2001年

2 周俊英;酒精性肝病發(fā)病機制及脂肝寧防治ALD作用機理的實驗研究[D];河北醫(yī)科大學;2006年

3 朱孔錫;線粒體DNA ATPase6，，8基因突變與大鼠酒精性肝病發(fā)生發(fā)展的相關性研究[D];山東大學;2006年

4 閻明;乙醇所致線粒體損傷與酒精性肝病機制的研究[D];山東大學;2006年

5 孫捷;德惠市飲酒與酒精性肝病流行病學現(xiàn)況調查及相關因素分析[D];吉林大學;2008年

6 趙海洋;鼠李糖乳桿菌對酒精性肝病的預防作用及分子機制研究[D];南京理工大學;2016年

7 崔克樂;天然免疫細胞在酒精性肝病中的作用機制研究[D];中國科學技術大學;2014年

8 曾斌芳;脂肪性肝病病證、用方用藥及其臨床的一體化研究[D];新疆醫(yī)科大學;2009年

9 陸春風;姜黃素逆轉酒精性肝纖維化的作用及機理研究[D];南京中醫(yī)藥大學;2017年

10 郭曉蘭;科羅索酸對酒精性肝損傷的作用及機制研究[D];山東大學;2017年

相關碩士學位論文 前10條

1 白雪;酒精性肝病合并橫紋肌溶解、急性腎衰竭病例解析與文獻復習[D];河北醫(yī)科大學;2019年

2 劉小佐;酒精性肝病合并2型糖尿病實例解析及文獻復習[D];河北醫(yī)科大學;2019年

3 楊潭;酒精性肝病臨床特征分析[D];濟南大學;2019年

4 盧觀婷;以器官損傷分層診斷慢性酒精性肝病的臨床研究[D];南方醫(yī)科大學;2019年

5 邊紅艷;Apelin對酒精性肝病中炎癥反應的作用研究[D];河南大學;2019年

6 陳亞男;盧秉久教授辨治酒精性肝病臨床用藥規(guī)律研究[D];遼寧中醫(yī)藥大學;2018年

7 郭悅;免疫指標與酒精性肝病關系的探究[D];山東大學;2019年

8 周珂;MicroRNA-29b在酒精性肝病中的作用及機制研究[D];安徽醫(yī)科大學;2019年

9 伏有為;基于Nrf2/ARE通路探究黃精速溶粉對酒精性肝病小鼠的保護作用及可能機制[D];安徽醫(yī)科大學;2019年

10 黃東東;SIRT2在酒精性肝病發(fā)生發(fā)展中的作用[D];上海交通大學;2017年

本文編號：2672450