【摘要】：背景酒精肝(alcoholic liver disease,ALD)是由于長期大量飲酒導(dǎo)致的肝臟疾病。初期通常表現(xiàn)為脂肪肝,進(jìn)而可發(fā)展為酒精性肝炎、肝纖維化和肝硬化,最終導(dǎo)致肝癌。酒精性肝病是一個全球性的公共衛(wèi)生問題,每年全球約有上百萬的ALD患者,具有很高的發(fā)病率及死亡率。Apelin作為一種重要的生物活性肽,是G蛋白偶聯(lián)受體APJ的內(nèi)源性配體,可以通過內(nèi)分泌、旁分泌、自分泌的方式激活其受體APJ并與其結(jié)合,從而發(fā)揮病理學(xué)和生理學(xué)方面的作用。目前,有關(guān)apelin/APJ在肝臟疾病中的作用仍在探索中,apelin在酒精性肝病中的研究至今鮮有報道,最近有關(guān)文獻(xiàn)表明在肝臟發(fā)生炎性損傷后,apelin的表達(dá)量明顯增加,由此探索apelin在酒精性肝臟中的表達(dá)情況以及它與酒精性肝病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系逐漸成為一個新的研究熱點(diǎn)。目的本實(shí)驗(yàn)研究的目的是探討在酒精性肝病中apelin與炎癥因子之間的相互作用及影響;驗(yàn)證apelin是否促進(jìn)酒精性肝病中炎癥因子的表達(dá),以及探索apelin促進(jìn)肝臟炎癥的機(jī)制。方法1.將RAW264.7細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中,按實(shí)驗(yàn)分組分為酒精量效關(guān)系組:(1)對照組;(2)0.05μmol/L;(3)0.1μmol/L;(4)0.2μmol/L;處理時間為24 h;酒精時效關(guān)系組:(1)0 h;(2)6 h;(3)12 h;(4)24 h;處理濃度為0.1μmol/L,qRT-PCR檢測apelin以及炎癥因子轉(zhuǎn)錄水平的變化,通過油紅染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚情況。2.在RAW264.7細(xì)胞中加入不同濃度以及不同時間點(diǎn)的apelin-13處理24 h后,通過Western blot及qRT-PCR檢測炎癥因子水平的變化。3.在RAW264.7細(xì)胞中加入酒精(0.1μmol/L)孵育24 h后加入不同濃度以及不同時間點(diǎn)的apelin-13處理24 h,通過Western blot及qRT-PCR檢測炎癥因子水平的變化。4.將RAW264.7細(xì)胞分為空載組,空載(1.6μg)+酒精(0.1μmol/L)組,過表達(dá)apelin組(1.6μg),apelin+酒精(0.1μmol/L)組,轉(zhuǎn)染24 h后按實(shí)驗(yàn)分組分別加酒精處理24 h后,通過Western blot及qRT-PCR檢測炎癥因子水平的變化,進(jìn)行鬼筆環(huán)肽染色觀察細(xì)胞微絲熒光表達(dá)的變化。5.將RAW264.7細(xì)胞分為si-con組,si-con+酒精(0.1μmol/L)組,si-apelin組,si-apelin+酒精(0.1μmol/L)組,轉(zhuǎn)染24 h后按實(shí)驗(yàn)分組分別加酒精處理24 h后,通過Western blot及qRT-PCR檢測炎癥因子水平的變化,進(jìn)行鬼筆環(huán)肽染色觀察細(xì)胞微絲熒光表達(dá)的變化。6.構(gòu)建酒精性肝病模型:選取6~8周C57BL/6雄性小鼠,19~23 g,適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后用于實(shí)驗(yàn),將野生雄性小鼠隨機(jī)分為3組:正常對照組;酒精處理組;apelin聯(lián)合酒精組。喂養(yǎng)10周后處死,部分肝組織用4%中性甲醛溶液固定保存其余肝組織于液氮中速凍,再移至-80℃冰箱長期保存。7.提取小鼠肝臟蛋白,Western blot檢測小鼠體內(nèi)炎癥因子的表達(dá)情況;免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測小鼠肝內(nèi)炎癥因子的表達(dá)情況;將小鼠肝臟組織經(jīng)超聲破碎勻漿后提取總RNA,qRT-PCR檢測肝臟組織炎癥相關(guān)因子轉(zhuǎn)錄水平的變化;酒精肝小鼠肝臟組織經(jīng)過處理后做HE染色,從形態(tài)學(xué)方面觀察小鼠肝臟損傷程度;通過油紅染色觀察小鼠肝組織內(nèi)脂質(zhì)積聚情況。結(jié)果1.在RAW264.7細(xì)胞中,給予不同濃度以及不同時間點(diǎn)的酒精刺激,qRT-PCR結(jié)果表明apelin、APJ以及炎癥因子IL-6、IL-1β、趨化蛋白MCP-1基因的轉(zhuǎn)錄水平隨酒精時間和劑量依賴性升高。2.油紅染色檢測RAW264.7細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚隨著酒精時間點(diǎn)以及濃度點(diǎn)梯度增加。3.在RAW264.7細(xì)胞中,單獨(dú)加入不同濃度以及不同時間點(diǎn)的apelin-13處理后,apelin-13能濃度依賴及時間依賴性促進(jìn)炎癥因子IL-6,IL-1β以及趨化蛋白MCP-1,PCNA的蛋白水平及轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)升高。4.在RAW264.7細(xì)胞中,先加入酒精孵育24 h后再給與不同濃度以及不同時間點(diǎn)的apelin-13刺激,造成炎癥因子及趨化蛋白MCP-1,PCNA表達(dá)量的升高。5.在RAW264.7細(xì)胞中,Western blot及qRT-PCR結(jié)果顯示,過表達(dá)apelin組與空載組相比,炎癥因子IL-6、IL-1β以及趨化蛋白MCP-1,PCNA表達(dá)量均升高;apelin聯(lián)合酒精(0.1μmol/L)組炎癥因子IL-6、IL-1β以及趨化蛋白MCP-1,PCNA表達(dá)量上調(diào)最為明顯。6.鬼筆環(huán)肽染色結(jié)果顯示過表達(dá)apelin組及apelin聯(lián)合酒精(0.1μmol/L)組較空載組及apelin組細(xì)胞內(nèi)微絲熒光顯色更強(qiáng)。7.在RAW264.7細(xì)胞中,通過Western blot及qRT-PCR結(jié)果表明敲低apelin組較正常組炎癥因子IL-6、IL-1β以及趨化蛋白MCP-1,PCNA表達(dá)量明顯降低。8.鬼筆環(huán)肽染色顯示在RAW264.7細(xì)胞中敲低apelin會使細(xì)胞內(nèi)微絲的熒光強(qiáng)度明顯減弱。9.Apelin通過RAW264.7細(xì)胞中的ERK信號傳導(dǎo)促進(jìn)肝臟炎癥的產(chǎn)生。10.動物實(shí)驗(yàn)中,經(jīng)HE染色結(jié)果可知,酒精刺激可使肝細(xì)胞變性壞死,apelin與酒精聯(lián)合處理組可見肝細(xì)胞廣泛壞死,炎性細(xì)胞浸潤明顯。油紅染色顯示,酒精刺激會使肝細(xì)胞脂肪變性,apelin處理能夠明顯增加肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積聚。11.免疫組化結(jié)果顯示酒精組較正常組相比,apelin、MCP-1、PCNA的棕色顆粒明顯增多,apelin與酒精聯(lián)合處理組棕色顆粒最多,其結(jié)果與Western blot結(jié)果相一致。12.動物實(shí)驗(yàn)中,qRT-PCR結(jié)果顯示apelin與酒精聯(lián)合處理組相較于酒精組的炎癥因子以及趨化蛋白MCP-1的轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)量明顯升高。13.動物實(shí)驗(yàn)中,Western blot結(jié)果顯示酒精性肝病小鼠肝組織中apelin與酒精聯(lián)合處理組相較于酒精組的MCP-1、PCNA、apelin蛋白的表達(dá)量明顯升高。結(jié)論1.在RAW264.7細(xì)胞中Apelin通過激活ERK信號通路促進(jìn)肝臟炎癥的產(chǎn)生。2.在小鼠酒精性肝病模型中,apelin可以加重肝細(xì)胞脂肪變性,促進(jìn)炎癥的產(chǎn)生。
【圖文】：

qRT-PCR 結(jié)果發(fā)現(xiàn)圖 3-1-A 和圖 3-1-B 中在加入酒精刺激后 apelin、APJ 基因的表達(dá)水平也隨著酒精的時間點(diǎn)和濃度點(diǎn)遞增，結(jié)果表明酒精可以促使炎癥的產(chǎn)生和發(fā)展，同時還會使 apelin、APJ 基因表達(dá)增加，由此我們認(rèn)為 apelin 與炎癥的發(fā)生發(fā)展存在著一定的關(guān)聯(lián)。

qRT-PCR 結(jié)果發(fā)現(xiàn)圖 3-1-A 和圖 3-1-B 中在加入酒精刺激后 apelin、APJ 基因的表達(dá)水平也隨著酒精的時間點(diǎn)和濃度點(diǎn)遞增，結(jié)果表明酒精可以促使炎癥的產(chǎn)生和發(fā)展，同時還會使 apelin、APJ 基因表達(dá)增加，由此我們認(rèn)為 apelin 與炎癥的發(fā)生發(fā)展存在著一定的關(guān)聯(lián)。
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R575

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本文編號：2672450