【摘要】： 第一部分：PPARγ、KLF6在大鼠NASH肝纖維化形成過程中的表達(dá)及意義 目的： 觀察核轉(zhuǎn)錄因子PPARγ、KLF6在大鼠NASH肝纖維化形成過程中的表達(dá)以及與肝星狀細(xì)胞活化、TGFβ1表達(dá)的相關(guān)性，探討其在非酒精性脂肪性肝纖維化發(fā)生中的作用。 方法： 1、建立NASH肝纖維化動(dòng)物模型：選用4周齡雄性Wistar大鼠(體重170～210g)60只隨機(jī)分為基礎(chǔ)飼料組(對照組，C組)、高脂飼料組(模型組，F(xiàn)組)，分別于喂養(yǎng)第8、12、16、24周4個(gè)時(shí)相點(diǎn)，稱重后麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，留取肝組織標(biāo)本，部分制成石蠟切片，行HE和Masson染色；部分-70℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?2、動(dòng)態(tài)觀察各組：①體重變化；②HE和Masson染色觀察肝臟組織病理改變；③血清游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)、甘油三脂(triglyceride，TG)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotrasferase，ALT)和天門冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotrasferase，AST)的變化；④放射免疫法檢測血清中透明質(zhì)酸(hyaluronic,HA)、層粘連蛋白(laminin,LN)、CⅣ型膠原(collagen typeⅣ，CⅣ)水平；⑤免疫組織化學(xué)法檢測PPARγ、KLF6、α-SMA的陽性表達(dá)率。⑥RT-PCR檢測肝組織PPARγ、KLF6、TGFβ1、α-SMA的mRNA表達(dá)； 結(jié)果： 1、體重情況：各組大鼠體重隨造模時(shí)間延長呈逐漸增高趨勢，但同一時(shí)相點(diǎn)比較模型組體重均高于相應(yīng)對照組(P0．05)； 2、HE和Masson染色結(jié)果：C組大鼠肝臟無異常發(fā)現(xiàn)；F組大鼠肝臟8周時(shí)出現(xiàn)單純性脂肪肝(F2-3)的病理變化，即以小泡性為主的混合性脂肪變性，無炎癥和纖維化；12周時(shí)除脂肪變性外，尚可見腺泡3帶少數(shù)氣球樣肝細(xì)胞，小葉內(nèi)炎細(xì)胞浸潤，點(diǎn)灶樣壞死，部分已演進(jìn)為非酒精性脂肪性肝炎，達(dá)NASH-F(2-4)G(0-1)S0診斷標(biāo)準(zhǔn)；16周時(shí)大鼠肝組織小葉內(nèi)炎癥進(jìn)一步加劇，匯管區(qū)亦可見炎細(xì)胞浸潤，腺泡3帶明顯的氣球樣肝細(xì)胞，部分大鼠肝組織出現(xiàn)竇周／細(xì)胞周纖維化，達(dá)NASH-F(3-4)G(1-3)S(0-1)診斷標(biāo)準(zhǔn)；24周大鼠仍呈中-重度脂肪肝，但部分大鼠炎癥程度較16周時(shí)有所減輕而均出現(xiàn)竇周／細(xì)胞周纖維化，尚可見明顯橋接樣纖維化，達(dá)NASH-F(3-4)G(0-2)S(1-3)診斷標(biāo)準(zhǔn)； 3、血清學(xué)指標(biāo)：F組血清TG、FFA水平8周起明顯增高，與對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0．71±0．08 vs 0．48±0．04；0．54±0．06 vs 0．34±0．04，P0．05)，并隨高脂飲食的延長逐漸升高；12周血清AST、ALT亦開始升高與對照組比較有差異(116±7．08 vs64．88±8．58；80．23±3．40 vs 44．35±3．38，P0．05)，16周達(dá)到高峰(148．2±8．33、101．6±6．79，P0．05)，24周略有下調(diào)(138．4±9．73、90．4±7．68)； 4、血清肝纖維化指標(biāo)的變化：F組12周時(shí)HA含量開始增高與對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(86．45±11．94 vs 63．57±9．49，P0．05)，并隨高脂飲食的延長逐漸升高；16周血清LN、CⅣ升高與對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(94．15±24．43 vs 71．93±11．84；59．41±8．89vs 27．87±8．49，P0．05)，24周增高最為明顯，與對照組比較差異顯著(131．67±59．96 VS71．93±11．84；86．31±32．78 vs 27．87±8．49，P0．01)： 5、免疫組織化學(xué)染色：PPARγ在C組肝細(xì)胞胞核中著色淺淡，呈散在分布、弱陽性表達(dá)，F(xiàn)組8周時(shí)在脂肪變性明顯的肝細(xì)胞核中表達(dá)開始增多，12周幾乎所有脂肪變性肝細(xì)胞核均可見棕黃色表達(dá)，16周隨脂肪性肝纖維化的出現(xiàn)，PPARγ陽性表達(dá)細(xì)胞較12周開始減少，24周PPARγ陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)進(jìn)一步減少，染色變淺呈淺棕褐色，尤其是肝纖維化形成部位PPARγ陽性染色細(xì)胞明顯減少；KLF6在C組肝臟中未見陽性表達(dá)，自12周起在脂肪變的肝細(xì)胞核中可見部分陽性表達(dá)，16、24周陽性表達(dá)逐漸增多；C組α-SMA僅在血管壁有少量表達(dá)，呈淺棕黃色染色，F(xiàn)組12周時(shí)，除血管壁可見陽性表達(dá)外，小葉內(nèi)可見少量陽性細(xì)胞表達(dá)，呈散在分布的淺棕褐色染色，16周陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)開始逐漸增多，并在纖維束沉積部位著色深，24周陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)最多、染色深，呈棕褐色，陽性細(xì)胞多位于匯管區(qū)、肝血竇周圍以及纖維間隔等處； 6、RT-PCR結(jié)果：F組大鼠8周時(shí)肝組織KLF6、TGFβ1、α-SMA mRNA表達(dá)與對照組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0．05)，12-24周KLF6 mRNA表達(dá)逐步上調(diào)，與對照組比較差異顯著(0．62±0．10、1．01±0．08、0．96±0．07 vs 0．24±0．05，P0．05)，16周TGFβ1、α-SMAmRNA表達(dá)開始上調(diào)，24周達(dá)到高峰與對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0．62±0．19、0．91±0．07 vs 0．36±0．16；0．77±0．12、1．08±0．19 vs 0．30±0．07，P0．05)；而PPARγmRNA于高脂喂養(yǎng)8周即明顯上調(diào)(0．84±0．07 vs 0．54±0．02，P0．05))，12周表達(dá)最為明顯(1．06±0．14)，16周脂肪性肝炎明顯時(shí)表達(dá)開始下降(0．73±0．01)，24周下降更為明顯，與對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0．36±0．02 vs 0．54±0．02，P0．05)。Pearson直線相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)：高脂24周NASH肝纖維化時(shí)KLF6mRNA與TGFβ1、α-SMA mRNA以及肝纖維化分級評分之間呈顯著正相關(guān)(r=0．848、0．859、0．706，P0．01)。 結(jié)論： 1、我們構(gòu)建的NASH肝纖維化模型是研究脂肪性肝炎肝纖維化發(fā)病機(jī)制的理想模型之一； 2、高脂飲食能夠誘導(dǎo)肝組織KLF6、TGFβ1、α-SMAmRNA和蛋白表達(dá)增強(qiáng)，且其高表達(dá)與非酒精性脂肪性肝纖維化形成關(guān)系密切，在單純性脂肪肝向脂肪性肝炎、肝纖維化進(jìn)展的過程中起重要作用； 3、高脂飲食誘導(dǎo)NASH大鼠肝臟PPARγmRNA和蛋白表達(dá)先升高后下降，推測高脂飲食誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷使脂肪變的肝細(xì)胞代償性合成PPARγ增加，抑制增高了的各種促炎、促纖維生成因子如KLF6、TGFβ1等的釋放；而當(dāng)損傷因素持續(xù)存在，損傷與抗損傷動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)后PPARγ合成減弱，而KLF6、TGFβ1等促纖維生成因子則明顯增加，激活HSC導(dǎo)致肝纖維化形成。 第二部分：PPARγ激動(dòng)劑羅格列酮對大鼠NASH肝纖維化形成的影響 目的： 觀察羅格列酮干預(yù)對NASH肝纖維化大鼠核轉(zhuǎn)錄因子KLF6信號(hào)通路的影響，探討羅格列酮的抗炎、抗肝纖維化效果及機(jī)制。 方法： 12只Wistar雄性大鼠高脂喂養(yǎng)8周后，給予4mg／kg／d羅格列酮干預(yù)(干預(yù)組，T組)，同時(shí)設(shè)立對照組(C組)和高脂模型組(F組)，24周末稱重后處死所有大鼠，留取血清及肝臟進(jìn)行血脂、肝功、肝纖維化標(biāo)志物、肝組織病理學(xué)染色以及RT-PCR檢測肝組織PPARγ、KLF6、TGFβ1、α-SMAmRNA和免疫組化檢測PPARγ、KLF6和α-SMA的表達(dá)。 結(jié)果：①HE和Masson染色顯示模型組大鼠24周末均可見典型脂肪性纖維化，治療組炎癥、纖維化程度均明顯減輕和改善，但與對照組相比其炎癥、纖維化程度仍有差異(P0．01)；②血清學(xué)指標(biāo)顯示羅格列酮干預(yù)16周后可明顯降低高脂飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)的TG、FFA、AST、ALT、HA、LN、CⅣ等的增高，兩組間差異顯著(P0．01)；③RT-PCR顯示24周后模型組KLF6(0．96±0．08)、TGFβ1(0．91±0．07)和α-SMA(1．07±0．19)的相對表達(dá)量均明顯上調(diào)，與對照組比較有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0．01)；治療組則顯示增高的上述基因呈不同程度的下調(diào)，兩組間差異顯著(P0．01)。④免疫組化顯示干預(yù)組KLF6、α-SMA的表達(dá)較模型組明顯減少，，PPARγ的表達(dá)則明顯增加，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0．05)。 結(jié)論： 1、羅格列酮可以激活PPARγ，下調(diào)NASH肝纖維化大鼠肝組織核轉(zhuǎn)錄因子KLF6及其下游靶基因TGFβ1的表達(dá)，抑制HSC的活化，阻止肝纖維化形成過程，這可能是其發(fā)揮抗肝纖維化的作用機(jī)制之一； 2、羅格列酮對高脂飲食誘導(dǎo)NASH肝纖維化大鼠具有一定的防治作用，可通過降低血脂，改善脂肪酸代謝紊亂，減輕炎癥反應(yīng)從而減輕肝纖維化程度。
【圖文】：

300bP150bp圖2一l羅格列酮對人鼠肝組織 KLF6mRNA表達(dá)的影響:、2對照組，3、4高脂模型組，5、6羅格列酮組900bP600bP450bP300bPp一ad功 TGFpl452bP298bP150bP圖2一2羅格列酮對大鼠肝紅{織丁GF甲mRNA表達(dá)的影響:、2對照組，3、4高脂模型組，5、6羅格列酮織以一S擬5時(shí)bP IPPPp obDbobob門 CUU工匕nOJ匕月4巧」150bP900bP600bp450bP350bP150bPp一 actIn45乃p圖2一3羅格列酮對大鼠肝織織a一SMAmRNA表達(dá)的影響:、2對照組，3、4高脂模型組，5、6羅格列酮組
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2006
【分類號(hào)】：R575.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2670963