【摘要】：目的:研究聚ADP-核糖基聚合酶1(PARP-1)對RAW264.7細胞內(nèi)HMGB1定位和分泌的影響,從亞細胞結(jié)構(gòu)來觀察HMGB1由胞核向胞漿移位的過程,為研究重癥急性胰腺炎的治療提供新的策略。 方法:用100ng/ml的LPS處理RAW264.7細胞1、2、4、8和16h,運用cell ELISA測定刺激后細胞內(nèi)PARP-1活性變化的時間規(guī)律;用LPS(100ng/ml)、LPS+3-AB(10mmol/l)刺激RAW264.7細胞1、2、4、8和16h,運用細胞免疫熒光在熒光顯微鏡下觀察HMGB1在細胞內(nèi)定位的時間變化規(guī)律,運用Western-blot的方法檢測HMGB1在細胞培養(yǎng)上清中的水平;構(gòu)建HMGB1-EGFP(wild type, WT)的表達質(zhì)粒和HMGB1NLS區(qū)域第40、47、179位谷氨酸突變?yōu)楸彼岬腍MGB1-EGFP(mutated type, MT)的表達質(zhì)粒,通過瞬時轉(zhuǎn)染到RAW264.7細胞中,用100ng/ml的LPS處理轉(zhuǎn)染后的細胞,在熒光顯微鏡下觀察HMGB1在細胞內(nèi)定位的情況。 結(jié)果: LPS刺激RAW264.7后,細胞中PARP-1活化,活性增強,在刺激后4小時達到高峰,隨后活性逐漸降低;HMGB1在刺激后1h開始由胞核向胞漿移位,隨著刺激時間的延長,逐漸向胞漿集聚;抑制PARP-1的活性可以減少HMGB1由胞核向胞漿的移位,抑制HMGB1向細胞外的分泌;HMGB1 NLS區(qū)域的谷氨酸突變后,不會減弱HMGB1由胞核向胞漿的移位,對HMGB1細胞內(nèi)定位沒有影響。 結(jié)論:PARP-1參與了RAW264.7細胞內(nèi)HMGB1的定位和分泌,它通過對HMGB1蛋白進行ADP-核糖基化修飾,來調(diào)控HMGB1在細胞中的定位及細胞外的分泌。HMGB1 NLS區(qū)域的谷氨酸突變對HMGB1的細胞內(nèi)定位沒有影響。3-AB通過抑制PARP-1的活性進而抑制HMGB1的ADP-核糖基化修飾,從而抑制HMGB1向胞漿的移位和細胞外的分泌過程。PARP-1抑制劑可以抑制HMGB1向細胞內(nèi)定位和細胞外分泌,為HMGB1引起的炎癥反應(yīng)的治療提供了新的思路。
【圖文】：

圖 1 LPS 刺激 RAW264.7 細胞后不同時間點 PARP-1 的活性變化OD 值大小代表 PARP-1 活性大小，*，P<0.05（與 0h 比較）如圖 1 所示，用 LPS 刺激 RAW264.7 細胞后，PARP-1 的活性在未刺

圖 2 LPS 刺激 RAW264.7 細胞后 HMGB1 的細胞內(nèi)定位情況（×200）用免疫熒光法觀察 LPS 刺激 RAW264.7 細胞后 HMGB1 在細胞內(nèi)的定位規(guī)律（見圖 2）。未用 LPS 刺激的對照組 RAW264.7 細胞中的綠色熒光主要定位于細胞核內(nèi)。而用 LPS 刺激的實驗組 RAW264.7 細胞，在刺激 1 小時后，在胞漿中即可觀察到綠色熒光，隨著刺激時間的延長，在刺激后 2h、4h、8h、16h，，細胞漿中的綠色熒光強度逐漸增強，而胞核的熒光強度減弱，在刺激 16h后，胞核和胞漿的熒光強度幾乎相等。三、 3-AB 對 LPS 刺激的 RAW264.7 細胞內(nèi) HMGB1 定位的影響
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R576

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 黃丹;黃愷;李小麗;楊崇哲;姚蘭;王敏;廖玉華;;PARP-1在LPS刺激人外周血單個核細胞產(chǎn)生炎性因子過程中的重要作用[J];臨床心血管病雜志;2007年01期

2 楊智勇,王春友,熊炯p

本文編號：2670894