【摘要】：目的:研究聚ADP-核糖基聚合酶1(PARP-1)對(duì)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)HMGB1定位和分泌的影響,從亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)來(lái)觀察HMGB1由胞核向胞漿移位的過(guò)程,為研究重癥急性胰腺炎的治療提供新的策略。 方法:用100ng/ml的LPS處理RAW264.7細(xì)胞1、2、4、8和16h,運(yùn)用cell ELISA測(cè)定刺激后細(xì)胞內(nèi)PARP-1活性變化的時(shí)間規(guī)律;用LPS(100ng/ml)、LPS+3-AB(10mmol/l)刺激RAW264.7細(xì)胞1、2、4、8和16h,運(yùn)用細(xì)胞免疫熒光在熒光顯微鏡下觀察HMGB1在細(xì)胞內(nèi)定位的時(shí)間變化規(guī)律,運(yùn)用Western-blot的方法檢測(cè)HMGB1在細(xì)胞培養(yǎng)上清中的水平;構(gòu)建HMGB1-EGFP(wild type, WT)的表達(dá)質(zhì)粒和HMGB1NLS區(qū)域第40、47、179位谷氨酸突變?yōu)楸彼岬腍MGB1-EGFP(mutated type, MT)的表達(dá)質(zhì)粒,通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到RAW264.7細(xì)胞中,用100ng/ml的LPS處理轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞,在熒光顯微鏡下觀察HMGB1在細(xì)胞內(nèi)定位的情況。 結(jié)果: LPS刺激RAW264.7后,細(xì)胞中PARP-1活化,活性增強(qiáng),在刺激后4小時(shí)達(dá)到高峰,隨后活性逐漸降低;HMGB1在刺激后1h開(kāi)始由胞核向胞漿移位,隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng),逐漸向胞漿集聚;抑制PARP-1的活性可以減少HMGB1由胞核向胞漿的移位,抑制HMGB1向細(xì)胞外的分泌;HMGB1 NLS區(qū)域的谷氨酸突變后,不會(huì)減弱HMGB1由胞核向胞漿的移位,對(duì)HMGB1細(xì)胞內(nèi)定位沒(méi)有影響。 結(jié)論:PARP-1參與了RAW264.7細(xì)胞內(nèi)HMGB1的定位和分泌,它通過(guò)對(duì)HMGB1蛋白進(jìn)行ADP-核糖基化修飾,來(lái)調(diào)控HMGB1在細(xì)胞中的定位及細(xì)胞外的分泌。HMGB1 NLS區(qū)域的谷氨酸突變對(duì)HMGB1的細(xì)胞內(nèi)定位沒(méi)有影響。3-AB通過(guò)抑制PARP-1的活性進(jìn)而抑制HMGB1的ADP-核糖基化修飾,從而抑制HMGB1向胞漿的移位和細(xì)胞外的分泌過(guò)程。PARP-1抑制劑可以抑制HMGB1向細(xì)胞內(nèi)定位和細(xì)胞外分泌,為HMGB1引起的炎癥反應(yīng)的治療提供了新的思路。
【圖文】：

圖 1 LPS 刺激 RAW264.7 細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn) PARP-1 的活性變化OD 值大小代表 PARP-1 活性大小，*，P<0.05（與 0h 比較）如圖 1 所示，用 LPS 刺激 RAW264.7 細(xì)胞后，PARP-1 的活性在未刺

圖 2 LPS 刺激 RAW264.7 細(xì)胞后 HMGB1 的細(xì)胞內(nèi)定位情況（×200）用免疫熒光法觀察 LPS 刺激 RAW264.7 細(xì)胞后 HMGB1 在細(xì)胞內(nèi)的定位規(guī)律（見(jiàn)圖 2）。未用 LPS 刺激的對(duì)照組 RAW264.7 細(xì)胞中的綠色熒光主要定位于細(xì)胞核內(nèi)。而用 LPS 刺激的實(shí)驗(yàn)組 RAW264.7 細(xì)胞，在刺激 1 小時(shí)后，在胞漿中即可觀察到綠色熒光，隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，在刺激后 2h、4h、8h、16h，，細(xì)胞漿中的綠色熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，而胞核的熒光強(qiáng)度減弱，在刺激 16h后，胞核和胞漿的熒光強(qiáng)度幾乎相等。三、 3-AB 對(duì) LPS 刺激的 RAW264.7 細(xì)胞內(nèi) HMGB1 定位的影響
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R576

【參考文獻(xiàn)】

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1 黃丹;黃愷;李小麗;楊崇哲;姚蘭;王敏;廖玉華;;PARP-1在LPS刺激人外周血單個(gè)核細(xì)胞產(chǎn)生炎性因子過(guò)程中的重要作用[J];臨床心血管病雜志;2007年01期

2 楊智勇,王春友,熊炯p

本文編號(hào)：2670894