【摘要】：目的：一氧化氮(NO)與一氧化碳(CO)是兩種重要的氣體信使分子，體內(nèi)分 別由一氧化氮合成酶(NOS)和血紅素合酶(HO)催化生成，可能參與肝硬化門脈高 壓及高動(dòng)力循環(huán)的形成過程。本研究的目的旨在檢測NOS-NO系統(tǒng)和HO-CO系統(tǒng)在大 鼠肝硬化模型的肝硬化不同階段靜脈血清NO及CO濃度以及肝組織內(nèi)NOS及HO的表 達(dá)，以探討其在肝硬化門脈高壓中的作用。 方法：以四氯化碳(CCl4) 聯(lián)合酒精的方法(40％CCl4 3ml／kg皮下注射，每5 天一次，首劑加倍；30％酒精為唯一飲用水：飲食采用玉米粉及豬油混合飼料)誘導(dǎo) 肝硬化大鼠模型，在肝硬化發(fā)生過程的不同時(shí)期收集肝硬化早期組(造模第15天， 13只)、肝硬化中期組(造模第30天，11只)，肝硬化晚期組(造模第52天，11 只)血清及肝臟標(biāo)本。另外收集一組正常大鼠標(biāo)本作為正常對照(正常飲食及飲水， 10只)。血清標(biāo)本從門靜脈及下腔靜脈采集并分別采用硝酸還原酶法和聯(lián)二亞硫酸 鹽還原法測定血清NO、CO濃度。部分肝組織標(biāo)本制備石蠟切片，以免疫組化ABC 法觀察iNOS、HO-1、 HO-2在肝臟內(nèi)的定位，并用計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)半定量監(jiān)測其 蛋白表達(dá)的強(qiáng)弱，灰階值越低說明表達(dá)越強(qiáng)。部分肝組織標(biāo)本以TRIZOL一步抽提法 提取RNA，，用半定量RT-PCR技術(shù)檢測iNOS、HO-1 mRNA的表達(dá)，同時(shí)檢測GAPDH的 表達(dá)作為內(nèi)參照，采用凝膠成像分析系統(tǒng)半定量mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果以目的條帶 與GAPDH密度比值R表示。 結(jié)果：正常及肝硬化早、中、晚期大鼠下腔靜脈血中NO濃度分別為71． 088± 8． 739、 102． 821±6． 783、 122． 499±4． 605和155． 843±10． 328μ mol/L：肝硬化早 期、中期和晚期大鼠下腔靜脈血中NO濃度均顯著高于對照組。 正常及肝硬化早、中、晚期大鼠門靜脈血中NO濃度分別為87． 025±7． 858、 115． 377±7． 935、 146． 222±8． 360和182． 811±8． 449μ mol／L；與對照組大鼠比較， 肝硬化早期、中期以及晚期大鼠的門靜脈血NO均顯著增高。 各組大鼠下腔靜脈血與門靜脈血相比，不論是對照組，還是肝硬化早期、中期、 晚期大鼠，其門靜脈血中NO濃度均顯著高于同組大鼠的下腔靜脈血NO的濃度。 免疫組化結(jié)果顯示肝硬化大鼠肝組織iNOS的表達(dá)陽性細(xì)胞主要是肝細(xì)胞，此外 復(fù)旦大學(xué) 博士學(xué)位論文 存在于少量竇上皮細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞。圖像分析結(jié)果顯示對照組、肝硬化早、中 和晚期組的iNOS灰階值分別為157.30士2.71、127.62士17.30、117.73士16.40和 108.00士10.68;說明各組肝硬化大鼠肝組織中iNOS的表達(dá)均顯著高于對照組。 對照組、肝硬化早期、中期和晚期大鼠肝組織中iNOSmRNA表達(dá)的R值分別為 0.3024士0.00449、0.4385士0.00582、0.7584士0.00759和0.8810士0.00729;各組 肝硬化大鼠的肝組織中iNOSmRNA的表達(dá)均明顯強(qiáng)于對照組。 正常及肝硬化早、中、晚期大鼠下腔靜脈血中CO濃度分別為17.210士3.120、 19.862士7.598、45.136士18.625和30.064士8.470協(xié)mol/L;肝硬化中期和晚期大 鼠下腔靜脈血中C0濃度顯著高于對照組。 正常及肝硬化早、中、晚期大鼠門靜脈血中C0濃度分別為17.080士5.107、 19.800士8.070、52.191士21.362和36.991士7.386pmol/L;與對照組大鼠比較肝 硬化中期和晚期CO濃度顯著增高。 不同組的肝硬化大鼠的門靜脈血和下腔靜脈血中的C0濃度隨著肝臟病變的逐漸 加重而增高，到中期肝硬化達(dá)峰值;肝硬化晚期時(shí)，有所回落。肝硬化中期、晚期 大鼠門靜脈血中C0濃度明顯高于下腔靜脈。 免疫組化結(jié)果顯示各組肝硬化大鼠及對照組肝組織表達(dá)HO一1、HO一2的陽性細(xì)胞 主要是肝細(xì)胞，此外見于少量竇上皮細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞。圖像分析結(jié)果顯示對照 組、肝硬化早、中、晚期組的HO一1灰階值分別為155.70士4.92、138.46士6.02、 121.18士9.40和124.18士7.56，各組肝硬化大鼠的灰階值顯著低于對照組大鼠，說 明各組肝硬化大鼠肝組織中HO一1的表達(dá)顯著高于對照組大鼠。對照組、肝硬化早、 中、晚期組的HO一2灰階值分別為154.60士6.79、140.15士6.36、128.27士10.80、 128.27土9.36，各組肝硬化大鼠的灰階值顯著低于對照組大鼠，說明各組肝硬化大 鼠肝組織中HO一2的表達(dá)顯著高于對照組大鼠。 對照組、肝硬化早、中、晚期大鼠肝組織中HO一lmRNA表達(dá)的R值分別為0.2798 士0.00263、0.3743士0.00473、0.6240士0.00954和0.8383士0.00694;肝硬化組肝 臟HO一lmRNA的表達(dá)明顯比對照組增高。 結(jié)論: 1.肝硬化大鼠NO濃度在早期就升高，晚期達(dá)高峰。門靜脈N0濃度明顯比下腔 靜脈高。肝硬化大鼠肝組織iNOS表達(dá)明顯上調(diào)，iNOSmRNA表達(dá)增加。 2.肝硬化大鼠血清CO濃度在中期才開始升高，晚期有所回落。肝硬化大鼠晚期 門靜脈血中CO濃度明顯高于下腔靜脈。肝硬化大鼠肝組織HO一1，HO一2表達(dá)明顯上 調(diào)，HO一lmRNA表達(dá)增加。 3.肝硬化大鼠及對照組肝組織內(nèi)表達(dá)iNOS、HO一1、HO一2的細(xì)胞主要是肝細(xì)胞、 少量的竇上皮細(xì)胞和Kupffer細(xì)胞。 復(fù)旦大學(xué) 博士學(xué)位論文 4.iNOS一N0系統(tǒng)與HO一C。系統(tǒng)在肝硬化門脈高壓中起著重要作用。
【圖文】：

2、基因測序證實(shí)測序結(jié)果:將PCR產(chǎn)物置入冰袋送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序(見圖1一8)。:，.1二111Ul13.CT‘CC及GC瓦C及‘及藍(lán)C了T藍(lán)IC‘IT腸呀及GCC及‘C了C了‘C及Ti及丁CC呀及“TC皿CI‘呀腸C圖1一8:大鼠iNOS測序結(jié)果3、同源性分析:將測序結(jié)果在www.ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)站上與基因庫內(nèi)資料對照，同源性94%。說明PCR產(chǎn)物就是1NOSmRNA的目的基因。見分析結(jié)果:Seore=304bits(158)，Expeet二4e一80Identities=170八80(94%)37

2、基因測序證實(shí)測序結(jié)果:將PCR產(chǎn)物置入冰袋送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序(見圖1一16)。婦.14.巧.1‘.1了.rCCCC及‘l腸CTT“CI互‘GCCI!“CC!全C了‘C‘C盈l!C?了C了了C幾“及CCr‘互CCC圖1一16:大鼠HO一測序結(jié)果3、同源性分析:測序結(jié)果在www.ncbi.nlm.nih.gov網(wǎng)站上與基因庫內(nèi)資料對照，同源性94%。說明PCR產(chǎn)物就是HO一lmRNA目的片段。見分析結(jié)果:51
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R575.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 王吉耀,劉建軍,賀伯明,張弛,楊長青;內(nèi)毒素對正常大鼠和肝硬化大鼠肝臟一氧化氮合酶活性及局部一氧化氮水平的影響[J];胃腸病學(xué);1999年02期

本文編號(hào)：2670696