【摘要】：【背景與目的】慢性胰腺炎(Chronic pancreatitis,CP)是一種進行性的慢性炎癥疾病,胰腺外分泌實質(zhì)常常被破壞,并由纖維組織所取代,主要表現(xiàn)為餐后腹痛,痛點常常位于上腹部,可向背部放射,惡心和嘔吐是常見的伴隨癥狀。腹痛是CP中最顯著的癥狀和主要的臨床挑戰(zhàn),是高達90%的患者住院的主要原因,也是臨床醫(yī)師治療CP時面對的巨大難題。盡管人們對CP導(dǎo)致腹痛的研究經(jīng)歷了一個從胰腺解剖學(xué)機制到神經(jīng)生物學(xué)機制的轉(zhuǎn)變,但尚未完全揭示CP時內(nèi)臟痛覺信息的上傳途徑及其在高級中樞部位的調(diào)控機制。胰腺感覺傳入纖維一部分經(jīng)雙側(cè)T4~L4節(jié)段的脊神經(jīng)上傳,一般進入脊髓背角換元以后,經(jīng)由脊髓丘腦束將感覺信息向上傳入高級中樞,如島葉和軀體感覺中樞,這一傳入途徑已被人們所熟知;另一部分傳入纖維經(jīng)雙側(cè)迷走神經(jīng)上傳,投射入腦干孤束核(nucleus tractus solitarii,NTS),NTS投射纖維向上多經(jīng)臂旁核傳遞到與情感有關(guān)的邊緣系統(tǒng)和高級認知中心。NTS作為重要的內(nèi)臟感覺上傳的中繼核,與痛相關(guān)皮層之間如何聯(lián)系及其功能調(diào)節(jié),目前尚無足夠證據(jù)。近年來對前扣帶回(anterior cingular cortex,ACC)在認知、情緒和疼痛等方面受到越來越多的關(guān)注。有研究在CP疼痛患者和動物模型的腦電圖和功能磁共振中觀察到ACC的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生重組現(xiàn)象,此外CP疼痛患者切除胰腺后仍殘留疼痛,提示ACC的中樞敏化在CP引起的內(nèi)臟痛的維持中起著關(guān)鍵的作用。然而CP疼痛信息經(jīng)NTS如何上傳至ACC,它們是否存在直接或間接的纖維聯(lián)系,ACC如何參與調(diào)節(jié)CP內(nèi)臟痛敏的機制,這些仍然不清。因此,本研究旨在建立三硝基苯磺酸(trinitrobenzene sulfonic acid,TNBS)誘發(fā)的CP大鼠內(nèi)臟疼痛模型,利用神經(jīng)束路追蹤法、形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)、電生理學(xué)和行為學(xué)等方法,觀察NTS向ACC的直接上行投射,檢測ACC內(nèi)的錐體神經(jīng)元及其突觸傳遞和谷氨酸受體在CP內(nèi)臟疼痛狀態(tài)下形態(tài)與功能發(fā)生的可塑性改變;同時結(jié)合藥理學(xué)、光遺傳學(xué)與化學(xué)遺傳學(xué)等方法進行干預(yù),探討ACC在CP內(nèi)臟痛敏的發(fā)生機制中的作用�！痉椒ā�(1)經(jīng)SD大鼠的胰膽管注射三硝基苯磺酸(TNBS)建立CP模型;利用HE染色觀察胰腺的病理變化;(2)應(yīng)用von Frey纖維絲、曠場實驗、高架十字迷宮實驗、大鼠轉(zhuǎn)棒疲勞儀實驗和強迫游泳實驗,進行大鼠行為學(xué)觀察,測定行為學(xué)變化的時相性;(3)將順標(biāo)示蹤病毒rAAV-CaMKIIα-EYFR-WPRE-pA注入NTS,觀察NTS向高級中樞的上行投射纖維聯(lián)系;免疫組織化學(xué)染色檢測CP術(shù)后NTS與ACC內(nèi)痛相關(guān)核蛋白FOS的表達;(4)應(yīng)用Med64多位點場電位方法誘發(fā)和記錄ACC內(nèi)多位點動作電位的長時程增強(LTP)現(xiàn)象及其變化;應(yīng)用全細胞膜片鉗技術(shù)記錄ACC V層錐體神經(jīng)元誘發(fā)的自發(fā)性興奮性突觸后電流(Spontaneous excitatory post synaptic currents,s EPSCs)和雙脈沖比值(paired pulse ratio,PPR);(5)利用免疫組化熒光雙重標(biāo)染色和Western blot方法分別觀察CP術(shù)后2周ACC內(nèi)囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體1(Vesicular glutamate transporter 1,VGluT1)的表達;運用Western blot方法分別檢測膜蛋白與漿蛋白中谷氨酸N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體亞型NR2B及磷酸化水平和α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異惡唑丙酸(AMPA)受體亞型GluR1的表達及磷酸化水平的變化;免疫電鏡技術(shù)觀察GluR1的分布及其與突觸后活性區(qū)的距離關(guān)系;(6)使用海人藻酸(Kainic acid,KA)損毀大鼠雙側(cè)ACC,檢測機械性刺激引起的內(nèi)臟痛反應(yīng)及其變化;利用藥理學(xué)實驗,在雙側(cè)ACC置管,1周后建立CP模型,3周后雙側(cè)微量注射NMDA受體拮抗劑DL-2-氨基-磷酸戊酸(DL-AP5)和AMPA受體拮抗劑6-氰基-7-硝基-喹喔啉-2,3-二酮(CNQX),1h后檢測機械性刺激引起的內(nèi)臟痛行為及其改變;(7)利用光遺傳學(xué)方法,將rAAV-CaMKIIα-ChR2-mCherry病毒注入CP組與sham組大鼠雙側(cè)ACC,1周后在ACC上方置光纖并建立CP模型,3周后在藍光照射下觀察機械性刺激引起的內(nèi)臟痛反應(yīng)和對曠場實驗進行觀察,檢測CP模型動物行為表現(xiàn)的改變;(8)利用化學(xué)遺傳學(xué)方法,將病毒rAAV-CaMKIIα-hM4Di-mCherry注入CP組與sham組大鼠雙側(cè)ACC,3周后腹腔給予CNO,1h后觀察機械性刺激引起的內(nèi)臟痛反應(yīng)和對曠場實驗進行觀察,檢測CP模型動物行為表現(xiàn)及其變化�！窘Y(jié)果】(1)大鼠CP模型的制作及胰腺的形態(tài)學(xué)變化TNBS誘發(fā)的CP模型大鼠與sham大鼠相比體重增加緩慢,胰腺出現(xiàn)小葉腺泡數(shù)減少、萎縮,小葉間纖維間隔變厚、并伴有水腫,及淋巴細胞浸潤等病理改變。(2)CP大鼠的內(nèi)臟痛行為學(xué)表現(xiàn)和對其高級腦功能活動的影響在術(shù)后7~28d,CP大鼠縮腹反應(yīng)閾值(abdominal withdraw threshold,AWT)下降;曠場實驗中總活動路程與中央活動路程百分比均降低;高架十字迷宮實驗結(jié)果顯示CP大鼠總穿梭次數(shù)與開臂滯留時間百分比均顯著下降;在強迫游泳實驗中,CP大鼠不動時間延長;轉(zhuǎn)棒實驗結(jié)果顯示,與對照組相比掉落潛伏期沒有顯著性差異。(3)NTS向ACC發(fā)出直接上行投射及其參與CP內(nèi)臟痛信息傳遞的形態(tài)學(xué)證明將病毒注射入NTS內(nèi)3-4周后直接灌注切片,結(jié)果顯示在ACC內(nèi)可以見到病毒順標(biāo)的纖維和終末;在制成CP模型的不同時間點,CP大鼠的NTS和ACC內(nèi)均可見到表達FOS蛋白的神經(jīng)元;隨著CP模型動物存活時程的延長,FOS陽性神經(jīng)元的數(shù)量顯著增多,且ACC的II-III層與V-VI層之間的FOS陽性神經(jīng)元數(shù)量具有顯著性差異;NTS和ACC內(nèi)FOS神經(jīng)元的數(shù)量變化具有一致性,兩者之間呈正相關(guān)關(guān)系。(4)CP內(nèi)臟痛敏大鼠ACC內(nèi)錐體神經(jīng)元突觸傳遞的可塑性變化Med64多通道場電位記錄結(jié)果顯示CP大鼠ACC內(nèi)錐體神經(jīng)元的放電幅值明顯減少,且產(chǎn)生LTP的通道數(shù)量和分布均減少。全細胞膜片鉗記錄CP大鼠ACC內(nèi)V層錐體神經(jīng)元,其s EPSCs的頻率和幅值增加,且CP大鼠ACC內(nèi)錐體神經(jīng)元的PPF幅值減少;電刺激誘發(fā)的AMPA受體和NMDA受體介導(dǎo)的興奮性突觸后電流增強;在電流鉗模式下觀察到了CP大鼠ACC錐體神經(jīng)元放電數(shù)目增加,引起動作電位的最小電流減少。(5)CP內(nèi)臟痛敏大鼠ACC內(nèi)谷氨酸含量及其受體表達和分布的可塑性變化免疫組化和Western blot結(jié)果證實CP大鼠ACC內(nèi)VGlu T1表達上調(diào);Western blot檢測分離膜蛋白和漿蛋白的結(jié)果表明CP大鼠膜蛋白內(nèi)GluR1、pGluR1、NR2B和p NR2B上調(diào),而漿蛋白內(nèi)GluR1、pGluR1和p NR2B表達不變,NR2B減少。免疫電鏡結(jié)果表明大鼠ACC內(nèi)的GluR1陽性標(biāo)記顆粒主要位于突觸后;CP大鼠ACC內(nèi)可見GluR1陽性標(biāo)記顆粒至突觸后膜的距離減少,提示它們有向突觸活性區(qū)移的傾向。(6)CP內(nèi)臟痛敏大鼠雙側(cè)ACC損毀或給予谷氨酸受體拮抗劑對動物內(nèi)臟痛行為和高級腦功能的影響雙側(cè)損毀ACC可以顯著的提高CP大鼠的縮腹反應(yīng)閾值,曠場實驗中損毀ACC的CP大鼠與對照CP大鼠相比,總活動路程和中央活動路程百分比顯著升高;雙側(cè)ACC給予AMAP受體拮抗劑DL-AP5和NMDA受體的拮抗劑CNQX,均可以顯著升高CP大鼠的縮腹反應(yīng)閾值,在曠場中,中央活動路程百分比顯著升高。(7)用光遺傳學(xué)和化學(xué)遺傳學(xué)方法分別激活和抑制CP內(nèi)臟痛敏大鼠ACC內(nèi)錐體神經(jīng)元的活動對動物內(nèi)臟痛行為和高級腦功能的影響光遺傳學(xué)實驗結(jié)果表明,藍光刺激激活A(yù)CC內(nèi)錐體神經(jīng)元不會影響CP大鼠的縮腹反應(yīng)閾值,在曠場實驗中,CP大鼠的總活動路程和中央活動路程百分比在刺激中與刺激前后對比也沒有統(tǒng)計學(xué)差異;化學(xué)遺傳學(xué)實驗表明,腹腔給予CNO抑制ACC內(nèi)錐體神經(jīng)元,可以提高CP大鼠的縮腹反應(yīng)閾值和在曠場中運動減少的情況,但對正常大鼠無影響�！窘Y(jié)論】(1)NTS至ACC存在直接的上行投射纖維聯(lián)系;TNBS胰膽管內(nèi)注射誘發(fā)CP引起的內(nèi)臟痛行為改變;NTS與ACC神經(jīng)元內(nèi)FOS表達量增加,且有時相性;CP內(nèi)臟痛大鼠運動減少與焦慮抑郁樣負性情緒有關(guān);(2)CP內(nèi)臟痛狀態(tài)下,ACC內(nèi)興奮性突觸傳遞增強,發(fā)生可塑性改變,其發(fā)生與谷氨酸的釋放及其受體表達變化有關(guān);(3)在CP內(nèi)臟痛狀態(tài)下,興奮ACC內(nèi)錐體神經(jīng)元不能加重CP大鼠的內(nèi)臟痛與負性情緒;而抑制ACC內(nèi)錐體神經(jīng)元興奮性可以有效緩解CP大鼠的內(nèi)臟痛和負性情緒。上述結(jié)果提示ACC可能是CP引起內(nèi)臟痛的一個潛在治療靶點。
【圖文】：

與 sham 組（圖 1-1 B）相比 TNBS 組動物（圖1-1 C）胰腺明顯萎縮，可見胰膽管擴張且有膽汁淤積。此外，建模后，與sham 組和 na ve 組相比，TNBS 組大鼠的體重增長緩慢（圖 1-1 D）。圖 1-1 胰膽管內(nèi) TNBS 注射建立慢性胰腺炎痛模型Figure 1-1 CP was induced by intraductal administration of TNBS

observed and compared by gross anatomical observation. D: TNBS-treated rats had decreased body weightalong the course of CP compared to sham group, while rat with sham surgery exhibited transient weightloss from POD 3 to 7 which returned to baseline after POD 14. n= 7 for each group, two-way ANOVA,*P<0.05, **P<0.01, ***P< 0.001, TNBS vs na ve; #P<0.05, ##P<0.01, sham vs na ve.胰腺 HE 染色結(jié)果顯示，na ve 組（圖 1-2A）和 sham 組（圖 1-2 B）胰腺組織的形態(tài)正常，而 TNBS-14d（圖 1-2 C）與 sham 相比，胰腺小葉腺泡數(shù)減少、萎縮，小葉間纖維間隔變厚、出現(xiàn)水腫，此外胰腺小葉內(nèi)及小葉纖維間隔均見中等量淋巴細胞浸潤。TNBS-28d（圖 1-2 D）與 sham 相比，胰腺小葉腺泡進一步萎縮，，小葉內(nèi)導(dǎo)管囊狀擴張，小葉內(nèi)及小葉間可見較多透明變性的纖維組織，伴中等量淋巴細胞浸潤。以上結(jié)果表明在 TNBS誘發(fā) CP 時，胰腺的改變符合臨床慢性胰腺炎患者炎癥病變[29]。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R576

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