【摘要】：Yes相關(guān)蛋白(YAP)是Hippo信號(hào)通路中重要的下游蛋白,在細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等方面具有重要作用,YAP還在各種肝臟疾病的進(jìn)展中發(fā)揮作用。然而,YAP在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展和逆轉(zhuǎn)中的功能及機(jī)制尚未被研究。在肝纖維化的進(jìn)展過程中,活化的肝星狀細(xì)胞增殖增加,凋亡減少,并且肝星狀細(xì)胞的凋亡是肝纖維化逆轉(zhuǎn)的一個(gè)關(guān)鍵途徑,因此我們猜想YAP是否能夠?qū)罨母涡菭罴?xì)胞增殖和凋亡產(chǎn)生作用�，F(xiàn)研究表明,在肝纖維化發(fā)生發(fā)展中,Wnt/β-catenin信號(hào)通路被激活,使得肝星狀細(xì)胞(HSCs)活化和增殖,同時(shí)YAP與Wnt/β-catenin信號(hào)通路有著密切的聯(lián)系,因此我們也探究了YAP是否能夠通過Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)節(jié)HSCs活化和增殖。為了研究YAP在肝纖維化進(jìn)展和逆轉(zhuǎn)的過程中的作用,我們向小鼠腹腔注射10%四氯化碳(CCl_4),每周2次,注射4周,建立小鼠肝纖維化模型,逆轉(zhuǎn)組的小鼠注射4周的10%CCl_4后停止注射,自然恢復(fù)6周,建立小鼠肝纖維化逆轉(zhuǎn)模型。我們通過谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的變化以及病理學(xué)檢測(cè)如HE,Masson和天狼猩紅染色證明模型的建立成功,并且提取小鼠肝臟組織的蛋白,原代肝星狀細(xì)胞的RNA,通過Western Blot和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)YAP的變化,發(fā)現(xiàn)YAP在肝纖維化小鼠中表達(dá)上升,而在逆轉(zhuǎn)組小鼠中表達(dá)降低。同時(shí)提取了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)刺激的HSC-T6細(xì)胞以及接著用脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化劑(MDI)逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的蛋白,通過Western Blot和RT-PCR檢測(cè)了YAP的變化,發(fā)現(xiàn)YAP在TGF-β1刺激的細(xì)胞中表達(dá)升高,而在MDI逆轉(zhuǎn)后表達(dá)降低。為了探究YAP的功能,我們使用YAP-siRNA沉默活化的HSC-T6細(xì)胞中的YAP,通過Western Blot,CCK-8實(shí)驗(yàn),細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)證明了沉默YAP后,HSC-T6細(xì)胞的活化和增殖被抑制,但是促進(jìn)了活化細(xì)胞的凋亡。為了繼續(xù)探究YAP在MDI處理的細(xì)胞逆轉(zhuǎn)中的作用,在MDI處理的細(xì)胞中使用SV40-YAP質(zhì)粒過表達(dá)YAP,通過Western Blot發(fā)現(xiàn)YAP的過表達(dá)抑制了MDI對(duì)于活化的HSC-T6細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)作用。我們又使用了YAP的抑制劑維替泊芬(VP)進(jìn)一步探究了YAP的功能,通過Western Blot,細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了VP抑制了HSC-T6細(xì)胞的活化,增殖,促進(jìn)了凋亡,進(jìn)一步證實(shí)了YAP的作用。在作用機(jī)制上,我們通過Western Blot檢測(cè)了沉默YAP后Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游靶基因比如C-myc和cyclinD1的表達(dá),發(fā)現(xiàn)YAP的沉默抑制了Wnt/β-catenin信號(hào)通路下游靶基因(C-myc和cyclinD1)的蛋白表達(dá),并且在MDI逆轉(zhuǎn)的細(xì)胞中過表達(dá)YAP后,發(fā)現(xiàn)β-連環(huán)蛋白(β-catenin),C-myc和cyclinD1的蛋白表達(dá)升高,翻轉(zhuǎn)了MDI對(duì)于Wnt/β-catenin信號(hào)通路的逆轉(zhuǎn)作用,證明了YAP能夠通過正向調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞的活化和增殖。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了YAP的沉默有助于肝纖維化的逆轉(zhuǎn),并且表明了YAP可能是HSCs激活和逆轉(zhuǎn)的有效靶點(diǎn)。
【圖文】：

果可知Vehicle Model Recovery圖 1 小鼠肝臟圖Fig.1 The figure of mouse liver果可知，正常組小鼠的肝臟肝小葉

Fig.2 HE staining were performed on liver tissue sections of mouse (×200sson 染色圖中肝臟肝細(xì)胞發(fā)生大量的脂肪變性圖 2 小鼠肝臟組織切片 HE 染色(×200)染色圖中，正常組的小鼠肝臟肝小葉正常，無纖維組織肝臟肝細(xì)胞發(fā)生大量的脂肪變性，并且有大量的纖維組織無纖維組織并且有大量的纖維組織
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R575

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本文編號(hào)：2666100