【摘要】： 背景與目的: 急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸是當(dāng)今外科領(lǐng)域研究的熱點,其發(fā)病機理尚未完全闡明。其中急性膽源性胰腺炎(acute biliary pancreatitis,ABP)在我國發(fā)病率最高,占AP總數(shù)的50-80%。目前普遍認(rèn)為,ABP是由于膽管炎癥、結(jié)石、寄生蟲、水腫、痙攣等病變使壺腹部發(fā)生梗阻,加之膽囊收縮,膽管內(nèi)壓力升高,膽汁通過共同通道反流入胰管,激活胰酶原,導(dǎo)致胰腺自身消化而引起胰腺炎。但其確切的發(fā)病機制尚未完全明確�？梢哉J(rèn)為,隨膽汁異常反流入胰管的膽汁酸,造成胰腺腺泡細胞功能與結(jié)構(gòu)損害是大多數(shù)ABP發(fā)病的一個關(guān)鍵性因素。因此,本研究探討膽汁酸7種不同成分對胰腺腺泡細胞的損傷作用,檢測在各種膽汁酸作用下胰腺腺泡細胞的存活率,凋亡/壞死的改變,觀察對腺泡細胞分泌功能的影響,并探究細胞核轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性的變化,研究大黃素對膽汁酸誘導(dǎo)的胰腺腺泡細胞損傷的保護性作用;同時,進一步揭示急性膽源性胰腺炎大鼠發(fā)病中,膽汁酸對胰腺的損傷性作用及其機制,觀察中藥清胰湯的治療作用,為揭示急性膽源性胰腺炎的發(fā)病機制和尋求更為有效的防治措施提供新的實驗佐證。 方法: 實驗一:以大鼠AR42J胰腺腺泡細胞系為研究對象,應(yīng)用MTT方法檢測7種不同膽汁酸對細胞存活率的影響和劑量與時間依賴性關(guān)系,采用光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡觀察細胞形態(tài)學(xué)改變與凋亡/壞死的變化,流式細胞術(shù)AV/PI雙染法檢測細胞的凋亡/壞死率。細胞經(jīng)0.4mM DCA作用15min,30min,1h,4h后分別收集細胞培養(yǎng)液上清檢測淀粉酶活性,提取細胞漿和細胞核蛋白,分別檢測各組細胞漿淀粉酶的活性,利用Luminex檢測40種細胞核轉(zhuǎn)錄因子(TF)的DNA結(jié)合活性的變化。 實驗二:大黃素(Emodin)是治療急性胰腺炎中藥方劑的一種主藥,通過體外實驗觀察其對膽汁酸誘導(dǎo)的胰腺腺泡細胞損傷的保護性作用和影響。以大鼠AR42J胰腺腺泡系為研究對象,分為三組,分別為CON組,0.4mM DCA刺激組和0.4mM DCA+Emodin(20μM)干預(yù)組,利用流式細胞術(shù)AV/PI雙染法檢測各組細胞凋亡/壞死率,以上各組進一步按照不同時間點分為4組:15min,30min,1h和4h,于相應(yīng)時間點分別收集細胞培養(yǎng)液上清檢測淀粉酶活性,提取細胞漿和細胞核蛋白,分別檢測各組細胞漿淀粉酶的活性,利用Luminex檢測40種細胞核轉(zhuǎn)錄因子(TF)的DNA結(jié)合活性的變化。 實驗三:經(jīng)膽胰管逆行注入不同濃度去氧膽酸鈉制備大鼠急性水腫性胰腺炎(AEP)和急性壞死性胰腺炎(ANP)模型。40只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、AEP組、ANP組及對ANP的清胰湯治療組(1ml/100g),每組10只。治療組大鼠于造模后立即一次和造模后12h再次給藥。24h后采取標(biāo)本做病理檢查和各項指標(biāo)檢測。光鏡下觀察各組胰腺標(biāo)本病理改變,進行組織學(xué)評分;采用TUNEL技術(shù)檢測胰腺腺泡細胞的凋亡,計算凋亡指數(shù);應(yīng)用分光光度法檢測凋亡蛋白酶Caspase-3,8和9的活性變化。 結(jié)果: 膽汁酸7中主要成分對胰腺腺泡細胞的損傷作用不同,其中DCA,CDCA,LCA和TDCA 4種膽汁酸細胞毒作用明顯,呈劑量和時間依賴性誘導(dǎo)腺泡細胞凋亡和壞死,CA,GCA和GDCA則不具有細胞毒作用。膽汁酸DCA和CA對腺泡細胞淀粉酶的合成與分泌功能均沒有顯著影響,在檢測的40種核轉(zhuǎn)錄因子(TF)的DNA結(jié)合活性中,DCA誘導(dǎo)AR42J胰腺腺泡細胞核內(nèi)ATF2,AR33,STAT5,NFAT,FKHR和NKX-2.5這6種核轉(zhuǎn)錄因子(TF)的DNA結(jié)合活性顯著升高,而RUNX/AML,NF-Y,MEF2和E2F1這4種TF的DNA結(jié)合活性則明顯下降,其余30種TF活性沒有明顯變化。 20μM Emodin可以減少DCA誘導(dǎo)的AR42J胰腺腺泡細胞的凋亡與壞死,對細胞淀粉酶的合成與分泌功能沒有明顯影響,同DCA誘導(dǎo)的TF活性變化相比,Emodin升高PAX3, E2F1, RUNX/AML, NF-Y, IRF, MEF和NFAT這5種TF活性,降低FKHR的活性。 大鼠體內(nèi)實驗結(jié)果表明,AEP組與ANP組腺泡細胞凋亡指數(shù)、Caspase-3,8和9的活性均顯著高于假手術(shù)組,且AEP組腺泡細胞凋亡指數(shù)及凋亡蛋白酶的活性水平顯著高于ANP組。同時,AEP組與ANP組病理組織學(xué)評分、血清淀粉酶、血清促炎性細胞因子等指標(biāo)均較假手術(shù)組顯著升高,且ANP組顯著高于AEP組(p0.01)。清胰湯通過誘導(dǎo)凋亡蛋白酶活性升高使ANP組大鼠胰腺腺泡細胞凋亡增多而壞死減輕,從而減輕胰腺組織損害和炎癥因子水平。 結(jié)論: 膽汁酸主要的7種成分中,DCA,CDCA,LCA和TDCA在0.3-0.4mM的較低濃度,在24h內(nèi)可導(dǎo)致大鼠AR42J胰腺腺泡細胞存活率顯著下降,這種細胞毒作用呈時間和劑量依賴性關(guān)系,而CA,GCA和GDCA這3種膽汁酸則在1.0mM濃度內(nèi)不會損傷腺泡細胞。膽汁酸對腺泡細胞的損傷作用主要表現(xiàn)為凋亡和壞死,對細胞內(nèi)酶的合成和分泌功能沒有明顯影響。研究發(fā)現(xiàn),DCA可誘導(dǎo)細胞6種TF的DNA結(jié)合活性顯著升高和4種TF的DNA結(jié)合活性顯著下降,從而影響相關(guān)基因的表達水平,是其造成細胞損傷的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。因此,本研究為膽汁酸誘導(dǎo)的胰腺腺泡細胞損傷提供有力的實驗依據(jù),并揭示了膽汁酸7種不同成分的作用特點和可能機制,將為探討膽源性胰腺炎的發(fā)病機制和防治措施提供參考。 Emodin對膽汁酸誘導(dǎo)的胰腺腺泡細胞損傷有一定的保護性作用,對細胞淀粉酶的合成與分泌功能沒有明顯影響。通過調(diào)節(jié)細胞TF的DNA結(jié)合活性,從而改變相關(guān)基因和蛋白的表達,可能是其發(fā)揮保護性作用的分子機制。 急性膽源性胰腺炎時,膽汁酸誘導(dǎo)的胰腺腺泡細胞損傷時疾病發(fā)生的重要因素,腺泡細胞損傷主要表現(xiàn)為凋亡和壞死,且凋亡的多少與病情輕重呈負相關(guān)的關(guān)系,腺泡細胞凋亡可能是急性胰腺炎時機體的保護機制之一。凋亡蛋白酶Caspase依賴的凋亡調(diào)控通路參與腺泡細胞的凋亡調(diào)節(jié),Caspase-8和9的活性均升高。清胰湯可通過誘導(dǎo)Caspase活性升高促進腺泡細胞凋亡而減輕ANP大鼠胰腺病理損害,降低血清淀粉酶、TNF-α、IL-6水平等,改善病情。如何有效控制AP發(fā)病時腺泡細胞的損傷,特別是減少壞死的發(fā)生,將會為臨床進一步降低ANP的重癥程度和病死率提供可能。
【圖文】：

圖 2.1 DCA 和C D C A 顯 著 抑 制A R 4 2 J 細 胞 的 生長和存活，隨作用時間趨勢越來越明顯。圖 2.2 隨培養(yǎng)時間的 延長， 在 DCA或 CDCA 作用下A R 4 2 J 細 胞 的 存活 率越來越低。*與 CON 組 比 較p < 0 . 0 5

39圖 5 AV/PI 雙染流式細胞圖 左上象限為壞死細胞，，右上象限為凋亡晚期和死細胞, 右凋亡早期細胞, 左下象限為正常細胞。 A：CON 組； B：0.8mM CA 組；C：0.4m組；D：0.8mM DCA 組。
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R576;R285.5

【參考文獻】

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本文編號：2665787