【摘要】： 目的:非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatis, NASH)是以肝實質細胞脂肪沉積和肝小葉內炎癥為特征的慢性肝臟疾病,與肥胖、高血糖癥、高脂血癥、高血壓等胰島素抵抗相關性疾病并存。抵抗素(resistin)是一種脂肪細胞因子,高水平抵抗素可誘導NASH的發(fā)生,其機制可能與抑制腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)磷酸化、促進炎癥因子的活化有關。研究非酒精性脂肪性肝炎發(fā)展的不同階段大鼠肝組織抵抗素與AMPK的表達情況及血清抵抗素的表達水平及其與肝組織病理變化(脂肪變性、炎癥、纖維化)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα, TNFα)水平等的關系,揭示抵抗素在NASH發(fā)病機制中的作用及地位,為NASH的預防及治療提供新的靶點。 方法:選用雄性Wistar大鼠40只隨機分為正常對照組(10只)和模型組(30只)。正常對照組給予標準飼料喂養(yǎng),模型組予以高脂飲食喂養(yǎng)(標準飼料加2%膽固醇、10%豬油和5%玉米油)。分別于8、12、16周經股動脈放血處死,組織學染色證明NASH造模成功。 留取血清,做血清生化指標、TNFα和抵抗素水平監(jiān)測。留取肝右葉組織分為四部分,一部分用于快速冰凍切片,行SudanⅣ染色;一部分用10%的甲醛固定以做HE(haematoxylin-eosin, HE)染色及Masson染色;一部分用4%多聚甲醛固定用于抵抗素免疫組化染色;其余肝組織經液氮速凍后置于-80℃冰箱, Western blot方法測定肝組織AMPKα的活性。 用日本Olympus AU2700全自動生化分析儀檢測血清膽固醇(cholesterol,TC),甘油三酯(triglyceride,TG),丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase,ALT),天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase , AST ) ;用酶聯(lián)免疫吸附測定( enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)測定血清TNFα和抵抗素水平。HE染色觀察肝組織普通病理變化;Masson染色觀察肝組織纖維化的程度;SudanⅣ染色,觀察肝細胞脂變程度;采用Power VisionTM二步法對肝組織進行抵抗素免疫組化染色。用多功能病理圖象分析儀測定抵抗素表達面積百分比,每張片子取中央和四周五個區(qū)域,20倍物鏡下計算平均面密度(陽性面積與統(tǒng)計場面積百分比)。采用Western blot方法測定肝組織AMPKα以及磷酸化AMPKα(P-AMPKα)蛋白的表達水平,以P-AMPKα/AMPKα比值代表AMPKα的活性。 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析實驗數(shù)據(jù)。 結果: 1大鼠的一般情況:隨著造模時間的延長,正常對照組大鼠食欲佳,皮毛光滑,精神狀態(tài)好,體重逐漸增加。模型組大鼠自造模開始至12周食欲亦佳,皮毛亦光滑,體重增加明顯快于正常對照組,但在造模12周后逐漸精神萎靡,食欲減退,皮毛欠光滑,體重停滯不增。 2各組大鼠生化指標及血清抵抗素、TNFα水平變化:8、12、16周模型組大鼠血清TC、TG、ALT、AST、TNFα水平以及抵抗素濃度均高于正常對照組(P0.01, P0.05),且隨著造模時間的延長逐漸升高(P0.01)。 3肝組織病理學變化:肉眼下,正常對照組大鼠肝臟呈紅褐色,明亮有光澤。模型組大鼠肝臟逐漸腫大,邊緣漸圓鈍,逐漸呈淺黃色或土黃色,切面油膩感增強。光鏡下HE染色可見正常對照組大鼠肝小葉結構完整,肝細胞大小一致,呈多邊形圍繞中央靜脈放射狀分布。造模8周大鼠肝組織顯示為單純性肝脂肪變性,造模12周大鼠肝組織出現(xiàn)炎癥細胞的浸潤和造型壞死,造模16周大鼠肝組織炎癥壞死程度加重。Masson染色顯示正常對照組、8周和12周模型組大鼠中央靜脈及匯管區(qū)未見明顯膠原纖維,16周模型組大鼠存在竇周及中央靜脈纖維化。SudanⅣ染色顯示正常對照組大鼠肝細胞胞漿內無紅染顆粒,隨造模時間的延長,肝細胞胞漿中逐漸出現(xiàn)紅色顆粒,且越來越密集。 4肝組織抵抗素表達:肝組織免疫組化染色顯示正常大鼠肝組織幾乎不表達抵抗素,造模8周大鼠肝組織中央靜脈周圍可見少量抵抗素表達,隨著造模時間的延長,肝組織抵抗素的表達明顯增加,以中央靜脈周圍最為顯著,匯管區(qū)周圍亦有少量表達,定量分析顯示四組間差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。 5肝組織AMPKα的活性:Western blot測定肝細胞胞漿內AMPKα和P-AMPKα蛋白表達水平,以P-AMPKα/AMPKα比值表示大鼠肝組織AMPKα的活性,結果顯示大鼠肝組織AMPKα活性隨造模時間的延長逐漸降低(P0.01或P0.05),且模型組均低于正常對照組(P0.01或P0.05),提示在NASH的進展過程存在AMPKα活性的降低。 結論: 1應用高脂飲食飼養(yǎng)大鼠可以成功復制NASH模型,其與NASH的發(fā)生發(fā)展關系密切。 2抵抗素在大鼠肝組織中的表達隨NASH的進展程度逐漸增多,主要集中于中央靜脈周圍。 3血清抵抗素濃度和肝組織抵抗素的表達量隨著造模時間的延長逐漸升高,且與TNFα水平呈正相關,表明抵抗素參與肝臟炎癥的發(fā)生,在NASH的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。 4大鼠肝組織AMPKα的活性隨造模時間的延長逐漸降低,與肝組織抵抗素表達量呈負相關,提示抵抗素參與NASH的形成可能與降低AMPK的活性有關。
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R575.1

【參考文獻】

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本文編號：2665733