【摘要】：凋亡(Apoptosis),又稱程序化細胞死亡,是機體維持自穩(wěn)狀態(tài)最重要的機制之一。健康成年人每天平均有500億至700億個衰老、惡變、或損傷的細胞發(fā)生凋亡,絕大部分凋亡細胞在啟動凋亡程序后裂解為凋亡小體(apoptotic body),凋亡小體被局部吞噬細胞識別并以一種非炎性的方式清除,同時新生細胞得以再生并籍此維持組織穩(wěn)態(tài)。理論上說凋亡是一種近乎完美的機制,但近年來,已有研究證實體細胞非正常凋亡與自身免疫性疾病有著千絲萬縷的關系,凋亡小體中包含的細胞內(nèi)成分如果沒有經(jīng)過有效的加工可能無法被吞噬細胞識別處理從而形成新的自身抗原,這種特殊的自身抗原被稱為凋亡新生抗原,其英文名apotope則源自凋亡(apoptosis)和抗原表位(epitope)。凋亡新生抗原的產(chǎn)生多由于靶細胞存在特異性分化缺陷,凋亡后無法加工分解某一類自體蛋白,導致該類蛋白經(jīng)由凋亡小體長期在局部吞噬細胞和抗原遞呈細胞中積累,并最終打破免疫耐受成為自身抗原,導致器官特異性自身免疫損傷。 原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary billary cirrhosis,PBC)是一種典型的器官特異性自身免疫性疾病,主要累及中年女性,在歐美40歲以上女性中發(fā)病率達到千分之一,在我國發(fā)病率也呈逐年上升的趨勢。PBC的主要病理學特征為免疫細胞特異性識別并殺傷肝內(nèi)膽管上皮細胞(human intrahepatic biliary epithelial cells,HiBEC),導致肝內(nèi)小膽管漸進性消失,肝內(nèi)膽汁淤積致肝組織反復再生并發(fā)生纖維化,最終導致肝硬化和肝功能衰竭,PBC整個病程長達20年以上,除部分晚期患者進行肝臟移植外,目前尚缺少有效治療手段。免疫學方面,PBC患者血清中存在高滴度自身抗體,目前已鑒定的自身抗原主要包括位于線粒體內(nèi)膜的丙酮酸脫氫酶復合體E2亞基(PDC-E2), 2-氧戊二酸脫氫酶復合體E2亞基(OGDC-E2)和支鏈2-氧酸脫氫酶復合體(BCOADC-E2),除自身抗體外,PBC患者體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)PDC-E2抗原特異性T細胞。 目前在PBC研究領域最重要的一個問題是:PDC-E2等自身抗體廣泛存在于各類有核細胞,為什么PBC患者的免疫系統(tǒng)卻特異性攻擊HiBEC細胞?換言之,免疫學研究需要解釋發(fā)生在PBC中的器官特異性問題。為解決這一問題,結合凋亡新生抗原理論,本研究提出以下假說并利用實驗驗證:人HiBEC細胞存在缺陷,導致某些線粒體內(nèi)膜蛋白在凋亡后無法降解,這些無法降解的蛋白通過凋亡小體被肝內(nèi)吞噬細胞和抗原遞呈細胞捕獲并遞呈,導致自身抗原外漏并可能最終引起免疫耐受的缺失引發(fā)疾病。在此基礎上,我們還想證明這些包含有PBC特異抗原的凋亡小體是否具有免疫原性,在PBC狀態(tài)下,我們認為凋亡的膽管上皮細胞釋放的凋亡小體主要可能影響2種細胞即專業(yè)吞噬細胞如巨噬細胞,樹突狀細胞和非專業(yè)吞噬細胞如膽管上皮細胞本身,已有報道證實PBC患者的巨噬細胞在膽管上皮細胞和凋亡小體和抗線粒體抗體同時刺激的情況下會大量釋放促炎性細胞因子,而膽管上皮細胞本身是否介入凋亡細胞的清除,如果介入,這些包含自身抗原的凋亡小體對膽管上皮細胞又有何影響?上述問題的解決將會更合理的解釋PBC中膽管上皮特異性損傷,并有助于揭示PBC更細致的免疫致病機制,為可能免疫學治療提供介入位點。 第一部分肝內(nèi)膽管上皮細胞的原代培養(yǎng)及凋亡的誘導 在此部分中研究中,我們主要建立了人HiBEC細胞,人乳腺上皮細胞,人支氣管上皮細胞和人表皮細胞的原代培養(yǎng)體系。人HiBEC細胞經(jīng)細胞角蛋白18,19免疫熒光染色鑒定陽性率達90%以上。在此基礎上我們分別利用親水性膽鹽甘氨鵝脫氧膽酸鈉(sodium glycochenodeoxycholate,GCDC),紫外輻射,以及抗Fas抗體誘導上述四種原代培養(yǎng)細胞凋亡。 結果表明GCDC可有效誘導四種原代培養(yǎng)細胞系發(fā)生凋亡,經(jīng)濃度梯度實驗證實GCDC在1mM時給藥4小時可以誘導達高達90%的人HiBEC細胞發(fā)生凋亡,同樣的條件也可以有效誘導約其他3種原代細胞發(fā)生凋亡(凋亡率40%-50%);而紫外輻射(強度1650 J/m2至2200J/m2)僅能誘導約25%原代細胞發(fā)生凋亡;盡管四種原代細胞表面均有較高強度的Fas表達,但給予Fas抗體卻幾乎無法誘導凋亡。親水性膽鹽為人膽汁內(nèi)主要毒性成分,利用GCDC誘導膽管上皮細胞凋亡較好的模擬了PBC中膽管上皮細胞的病理性凋亡。我們隨后利用超速離心收集了培養(yǎng)上清中的凋亡小體用于下一階段凋亡新生抗原的研究。 第二部分肝內(nèi)膽管上皮細胞凋亡新生抗原的鑒定 在此部分的研究中,我們分離了4種細胞經(jīng)GCDC誘導凋亡后的凋亡小體,并利用免疫印跡和激光共聚焦顯微鏡研究了3種PBC特異性自身抗原(PDC-E2,OGDC-E2,BCOADC-E2),4種線粒體內(nèi)膜蛋白(DECR1,UQCRC2,COX IV,ATPB),和3種PBC相關的核蛋白抗原(SSA,SSB,SP100)在4種凋亡小體中分布情況。我們發(fā)現(xiàn)兩種PBC特異抗原PDC-E2,ODDC-E2以全長抗原的形式特異性的存在于HiBEC細胞來源的凋亡小體,另一種PBC特異性抗原BCOADC-E2除了存在于HiBEC來源的凋亡小體,同時也在另外兩種上皮細胞(MaEPC,BrEPC)來源的凋亡小體中被檢測到。此外,在4種其他線粒體內(nèi)膜蛋白中,DECR1也特異性的存在于HiBEC細胞來源的凋亡小體,我們沒有發(fā)現(xiàn)核蛋白抗體特異性的存在與HiBEC來源的凋亡小體中。至此,我們檢測到所有3種PBC特異性抗原都在膽管上皮細胞凋亡小體中以全長蛋白形式特異性的存在。 我們的研究結果揭示了人類上皮細胞廣泛的存在凋亡后蛋白清除缺陷,由于細胞凋亡的持續(xù)存在,這些未經(jīng)處理的蛋白在進入局部吞噬細胞或抗原遞呈細胞后很可能被識別為外源性蛋白而誘發(fā)免疫應答和免疫損傷。更重要的是在HiBEC細胞,這一缺陷卻恰好導致PDC-E2,OGDC-E2和BCOADC-E2的凋亡后清除障礙,而這三種蛋白是已知的最重要三種PBC自身抗原,我們的發(fā)現(xiàn)為PBC中致病機制中包括自身抗原來源,以及膽管特異性損傷等一系列問題提供了較好的一個相對較合理的解釋。 第三部分PBC患者血清中抗肝內(nèi)膽管上皮細胞凋亡新生抗原抗體的鑒定 在此部分研究中,我們基于對上述HiBEC凋亡新生抗原的鑒定結果繼續(xù)研究這些新生抗原是否在PBC患者中引發(fā)了免疫耐受的缺失,我們從PBC血清庫中選取了114例PBC患者的血清,其中95例為抗線粒體抗體陽性,19例為抗線粒體抗體陰性,并隨機選取性別年齡相當?shù)?6例對照血清,其中包括23例系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus , SLE ) , 22例原發(fā)性硬化性膽管炎(primary sclerosing cholangitis,PSC)以及31例健康對照。利用免疫印跡檢測了患者血清中凋亡新生抗原自身抗體的分布情況。 結果顯示在95例抗線粒體抗體陽性的患者中全部(100%)檢測到了PDC-E2抗體,19例(20%)檢測到了OGDC-E2抗體,25例(26%)檢測到了BCOADC-E2抗體,值得一提的是我們新鑒定的膽管上皮細胞特異性凋亡新生抗原DECR1也在3例患者中檢測到了抗體,提示PBC患者中存在針對DECR1的自身免疫也進一步驗證了我們提出的凋亡新生抗原是潛在的自身抗原來源的假說。此外,抗線粒體抗原陰性患者血清中未能檢測到任何針對凋亡新生抗原的抗體。 第四部分肝內(nèi)膽管上皮細胞對自身來源的凋亡小體免疫學反應 本研究小組已經(jīng)報道膽管上皮細胞來源的凋亡小體具有免疫原性,可以在AMA存在的條件下刺激PBC患者的巨噬細胞產(chǎn)生大量炎性細胞因子。此外,已有報道證實PBC患者肝內(nèi)膽管上皮細胞表面有PDC-E2。為此在此部分研究中我們欲證實凋亡小體是否是患者肝內(nèi)膽管上皮細胞表面PDC-E2的來源.我們首先證實了膽管上皮細胞表面表達包括CD51,CD61,CD93,磷酯酰絲氨酸受體(PSR)等多種吞噬相關受體以及包括TLR1,TLR2,TLR3,TLR4,TLR9在內(nèi)的toll樣受體。將熒光染色后HiBEC誘導凋亡,收集凋亡小體后與正常HiBEC共培養(yǎng),經(jīng)流式細胞術證實的共培養(yǎng)HiBEC內(nèi)細胞可檢測到熒光信號,提示HiBEC直接參與凋亡小體的清除。經(jīng)激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)HiBEC內(nèi)部存在大量熒光染色的凋亡小體。隨后我們收集了共培養(yǎng)HiBEC細胞上清和細胞,檢測上清中多種促炎性細胞因子及趨化因子水平,發(fā)現(xiàn)經(jīng)凋亡小體共培養(yǎng)后HiBEC并不分泌炎性細胞因子,但趨化因子CXCL-8和CCL-2水平較未刺激組升高約3倍,我們隨后將HiBEC細胞裂解后提取RNA,利用人趨化因子PCR芯片分析HiBEC吞噬凋亡小體后趨化因子的表達譜,結果顯示HiBEC吞噬凋亡小體后明顯上調(diào)包括CCL8、CCL7、CCL16、CCL13在內(nèi)的CCL家族趨化因子的表達。提示HiBEC通過分泌CCL家族趨化因子吸引更多的專業(yè)免疫細胞參與凋亡的清除。
【圖文】：

條件下的培養(yǎng)基對照組的凋亡率僅為10.4%±1.2%（HiBEC）至8.0%±1.1%（KC），兩組間兩兩比較存在明顯統(tǒng)計學差異（P＜0.01）,提示GCDC可以有效誘導4種原代細胞發(fā)生凋亡。（圖1-1，1-2）。圖 1-1GCDC 誘導 HiBEC 發(fā)生凋亡。1mM GCDC 作用于原代培養(yǎng) HiBEC,10 小時候利用流式細胞術檢測凋亡率。如圖所示，90%的 HiBEC 表現(xiàn)為早期凋亡（AnnexinV 陽性/7AAD 陰性）第09期 榮光華：人肝內(nèi)膽管上皮細胞凋亡新生抗原與原發(fā)性膽汁性肝硬化膽管特異性損傷相關性的研究... E064-12-13

2.03%（KC）到24.9±2.3%（MaEPC），相同條件下的培養(yǎng)基對照組的凋亡率僅為5.2%±0.5%（HiBEC）至3.8%±0.9%（KC），兩組間兩兩比較存在明顯統(tǒng)計學差異（P＜0.01）,提示紫外輻射也可以有效誘導4種原代細胞發(fā)生凋亡。（圖1-3）我們最后利用Fas抗體在4種原代培養(yǎng)細胞誘導凋亡，盡管我們在4種原代培養(yǎng)細胞表面均檢測到了Fas（圖1-4），但給予Fas抗體后凋亡率從2.8±1.1%（HiBEC）到1.7±0.3%（BrEPC），相同條件下的培養(yǎng)基對照組的凋亡率為2.4%±1.0%（MaBEC）至1.7%±0.6%（KC），兩組間兩兩比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），提示Fas抗體基本無法誘導4種原代培養(yǎng)細胞發(fā)生凋亡（圖1-5）圖1-3 紫外照射后可誘導4 種原代培養(yǎng)細胞發(fā)生少量凋亡。凋亡率為Annexin V 陽性/ 7AAD 陰性細胞占細胞總數(shù)的比例，，柱圖代表三次不同實驗的均數(shù)和標準差。相關博士學位論文 2011年 第09期 醫(yī)藥衛(wèi)生科技輯 E064-12-14
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R575.2

【參考文獻】

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1 Ralph Feltens;Thomas Pfeiffer;;Cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4 gene polymorphisms confer susceptibility to primary biliary cirrhosis and autoimmune hepatitis in Chinese population[J];World Journal of Gastroenterology;2004年20期

2 Hiroaki Yokomori;Masaya Oda;Mariko Ogi;Go Wakabayashi;Shigeyuki Kawachi;Kazunori Yoshimura;Toshihiro Nagai;Masaki Kitajima;Masahiko Nomura;Toshifumi Hibi;;Expression of adhesion molecules on mature cholangiocytes in canal of Hering and bile ductules in wedge biopsy samples of primary biliary cirrhosis[J];World Journal of Gastroenterology;2005年28期

3 Vasiliy Ivanovich Reshetnyak;;Concept on the pathogenesis and treatment of primary biliarycirrhosis[J];World Journal of Gastroenterology;2006年45期

本文編號：2664619