【摘要】： 原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)是一種慢性進(jìn)行性膽汁淤積性自身免疫性肝病,以肝內(nèi)中、小膽管損傷為主,其病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確。其血清學(xué)特征主要是抗線粒體抗體(AMA),尤其是抗M2亞型抗體陽性,陽性率可達(dá)95%以上。M2有多個抗原,其中最主要的是丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E2亞基(PDC—E2),其次是2-氧戊二酸脫氫酶復(fù)合體(OGDC)和支鏈2-氧酸脫氫酶復(fù)合體(BCOADC)的E2亞基。由于PDC-E2與PBC的特殊關(guān)系,人們對其進(jìn)行了深入的研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在PBC患者BECs表面表達(dá)PDC-E2,那么PDC-E2對BECs有何作用?尚待研究。 Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是病原微生物各種成分的模式識別受體(Pattern recognition receptor,PRR),在聯(lián)系固有免疫和獲得性免疫中起到重要的橋梁作用。TLR4是Medzhitov等于1997年發(fā)現(xiàn)和鑒定的第一個人類TLR,其天然配體是革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁成分——脂多糖(LPS)。此外,尚存在多種內(nèi)源性物質(zhì),如熱休克蛋白(HSP)60、HSP22、透明質(zhì)酸、HMGB、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、髓系相關(guān)蛋白(Mrp)8和Mrp14等都可以活化TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,參與多種自身免疫性疾病的發(fā)生。 近來研究表明,PBC患者肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞(intrahepatic biliary epithelial cells,IBECs)TLR4表達(dá)明顯上調(diào);體外培養(yǎng)的PBC患者外周血單核細(xì)胞對LPS的反應(yīng)性明顯增高;LPS可以通過活化NF—κB和MAPX途徑刺激BEGs分泌炎癥因子或趨化因子IL-6、MCP-1及IL-8。上述研究提示:一、人BECs有TLR4表達(dá);二、TLR4參與的天然免疫在PBC發(fā)病中具有一定作用。但很多PBC患者包括本研究所選病例并未檢測到病原體或LPS,那么是什么原因使TLR4表達(dá)增高呢?是否存在其它內(nèi)源性成分可以被TLR4識別,從而上調(diào)TLR4表達(dá),刺激TLR4通路活化?尚無文獻(xiàn)報道。 基于以上研究現(xiàn)狀,我們提出了這樣一個假設(shè):表達(dá)于HIBEC的線粒體M2蛋白可以通過活化TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)HIBEC表達(dá)ICAM-Ⅰ等黏附分子,分泌MCP-1、IL-8、MIP-1α等趨化因子,招募單核/巨噬細(xì)胞等各種炎癥細(xì)胞或免疫細(xì)胞,M2蛋白還可以通過TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化單核/巨噬細(xì)胞,促進(jìn)其分泌TNF-α、IL-12、sTRAIL等炎癥因子和細(xì)胞因子,從而引起HIBEC的損傷,導(dǎo)致PBC的發(fā)病。為證實這一假設(shè),我們進(jìn)行了下面的研究:一、檢測PBC患者外周血白細(xì)胞TLR4的表達(dá),從臨床水平探討TLR4與PBC的關(guān)系;二、從細(xì)胞水平探討M2蛋白通過TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對HIBEC的作用;三、探討M2蛋白對單核細(xì)胞的作用及其與TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)系。 第一部分Toll樣受體4在原發(fā)性膽汁性肝硬化患者外周血白細(xì)胞的表達(dá)及臨床意義研究 在本部分研究中,我們主要檢測了TLR4在PBC患者外周血白細(xì)胞中的表達(dá),并以乙肝后肝硬化和健康人群為對照,探討了外周血白細(xì)胞TLR4的表達(dá)改變與PBC發(fā)病的關(guān)系。30例PBC患者,20例疾病對照及30名健康個體外周血白細(xì)胞TLR4基因和蛋白的檢測分別應(yīng)用實時熒光定量RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)(FCM)的方法;血清細(xì)胞因子的檢測采用ELISA方法;GGT和ALP通過全自動生化分析儀測定結(jié)果。 結(jié)果顯示,PBC患者和乙肝后肝硬化患者外周血單核細(xì)胞TLR4蛋白的陽性表達(dá)率及PBMCs的TLR4 mRNA表達(dá)量均顯著高于健康對照組(P＜0.05),各組人群外周血單核細(xì)胞TLR4蛋白陽性表達(dá)率均與外周血PBMCs中TLR4 mRNA表達(dá)水平成顯著相關(guān)性。PBC患者和乙肝后肝硬化患者血清細(xì)胞因子TNF-α和IL-12濃度均顯著高于健康對照。PBC患者血清ALP和GGT濃度顯著高于乙肝后肝硬化患者和健康對照。PBC患者外周血白細(xì)胞TLR4基因和蛋白的表達(dá)水平與TNF-α及IL-12均呈顯著相關(guān)性,而與血清ALP和GGT無明顯的相關(guān)性。這些結(jié)果提示,TLR4及其信號通路的異常與PBC的發(fā)病密切相關(guān)。 第二部分線粒體M2蛋白通過TLR4通路對人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的作用為探討人肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞(HIBEC)表面線粒體M2蛋白對HIBEC的作用及其與TLR4的關(guān)系,我們在本部分研究中體外培養(yǎng)了HIBEC。首先,應(yīng)用FCM分析不同濃度線粒體M2蛋白對HIBEC表面TLR4表達(dá)的影響;然后,分別以FCM、ELISA、Western blot及EMSA技術(shù)分析了siRNA封閉TLR4信號通路前后,M2蛋白對HIBEC的作用,包括:凋亡情況、黏附分子ICAM-Ⅰ的表達(dá)、趨化因子MCP-1、IL-8及MIP-1α的分泌、細(xì)胞內(nèi)IκB和pJNK含量及NF-κB活性,并以張氏肝細(xì)胞作為對照。 結(jié)果顯示:1)HIBEC和張氏肝細(xì)胞均有TLR4的表達(dá),HIBEC細(xì)胞TLR4的陽性表達(dá)率為[(70.3±2.3)%]明顯高于張氏肝細(xì)胞[(9.6±0.4)%]。2μg/ml線粒體M2蛋白刺激24小時即可使HIBEC和張氏肝細(xì)胞TLR4的陽性表達(dá)率明顯增加(P＜0.05),且呈濃度依賴性。2)不同濃度M2蛋白刺激HIBEC 24h,早期凋亡均有明顯增加,但無濃度依賴性;siRNA封閉TLR4后,2μg/mlM2組早期凋亡無明顯變化;而10μg/ml和50μg/mlM2組,HIBEC早期凋亡顯著增加,尤以濃度為10μg/mlM2組增加更為明顯。與HIBEC不同,各種濃度刺激張氏肝細(xì)胞24h,細(xì)胞早期凋亡均無顯著增加,甚至有下降的趨勢。siRNA沉默TLR4基因后,各種濃度M2蛋白刺激均會使張氏肝細(xì)胞早期凋亡顯著增加,尤以10μg/ml和50μg/ml的M2組更為明顯。3)濃度為2μg/ml的線粒體M2蛋白刺激24h后,HIBEC表面ICAM-Ⅰ的陽性表達(dá)率即顯著高于空白對照;當(dāng)M2蛋白濃度增加到10μg/ml和50μg/ml時,ICAM-Ⅰ的陽性表達(dá)率有下降趨勢,但仍顯著高于空白對照。siRNA沉默TLR4基因后,ICAM-Ⅰ的陽性表達(dá)率均顯著降低。與HIBEC不同,在無任何刺激的情況下,張氏肝細(xì)胞表面ICAM-Ⅰ的陽性表達(dá)率明顯高于HIBEC;濃度為2μg/ml和10μg/ml的M2蛋白刺激24h時,張氏肝細(xì)胞表面ICAM-Ⅰ的陽性表達(dá)率較空白對照無明顯增加,當(dāng)M2蛋白濃度為50μg/ml時,張氏肝細(xì)胞表面ICAM-Ⅰ的陽性表達(dá)率才顯著增加;有趣的是,siRNA沉默TLR4基因后,ICAM-Ⅰ的陽性表達(dá)率顯著增高。4)M2蛋白刺激前后,HIBEC和張氏肝細(xì)胞均不分泌趨化因子MIP-1α,張氏肝細(xì)胞亦幾乎不分泌趨化因子MCP-1,二者均分泌趨化因子IL-8,濃度為2μg/ml M2刺激HIBEC 24h,細(xì)胞分泌IL-8基本不受影響,M2濃度為10μg/ml時,分泌IL-8明顯增高,且呈濃度依賴。siRNA封閉TLR4基因后,HIBEC分泌IL-8明顯下調(diào)。各種濃度M2蛋白刺激24h,對張氏肝細(xì)胞分泌IL-8的影響并不明顯,甚至高濃度的M2(50μg/ml)蛋白有抑制張氏肝細(xì)胞分泌IL-8的趨勢。M2蛋白刺激HIBEC 24h,細(xì)胞分泌MCP-1亦明顯增加,且有濃度依賴性,siRNA封閉TLR4基因后,MCP-1明顯下調(diào)。5)濃度為50μg/ml的線粒體M2蛋白刺激HIBEC和張氏肝細(xì)胞,細(xì)胞內(nèi)均未檢測到pJNK;HIBEC細(xì)胞內(nèi)IκB-α含量明顯減少,SiRNA使TLR4基因沉默后,IκB-α含量又明顯增加,而張氏肝細(xì)胞內(nèi)IκB-α含量無明顯變化。6)PDTC封閉NF-κB與siRNA封閉TLR4結(jié)果相似。 本部分研究結(jié)果表明,M2蛋白可以上調(diào)HIBEC表面TLR4的表達(dá),并通過活化TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路并以NF-κB依賴途徑促進(jìn)HIBEC表達(dá)黏附分子,分泌趨化因子,招募各種免疫細(xì)胞,損傷HIBEC,引起PBC發(fā)病。但M2蛋白本身對HIBEC的凋亡作用卻受TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制,其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。 第三部分線粒體M2蛋白通過TLR4通路對單核細(xì)胞的作用 研究表明,PBC患者肝門管區(qū)有大量的炎性細(xì)胞浸潤,包括淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等。已經(jīng)證明,自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞可以識別PDC-E2的某幾段表位,如PDC-E2_(159-167)和PDC-E2_(163-176),B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的IgA抗體亦可識別PDC-E2。但關(guān)于單核細(xì)胞的作用以及單核細(xì)胞與線粒體M2蛋白的關(guān)系尚未明確。因此,我們在這部分研究中以U937細(xì)胞作為單核細(xì)胞模型,探討了線粒體M2蛋白對單核細(xì)胞的影響及TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在其中所起的作用。首先,我們應(yīng)用FCM分析了線粒體M2蛋白對U937細(xì)胞表面TLR4表達(dá)的調(diào)節(jié)作用;然后,我們分別應(yīng)用ELISA、Westernblot及EMSA技術(shù)分析了siRNA封閉TLR4基因前后,M2蛋白對單核細(xì)胞的作用,包括:對TNF-α、IL-12、sTRAIL等細(xì)胞因子的分泌、細(xì)胞內(nèi)IκB和pJNK含量及NF-κB活性的影響。 結(jié)果顯示:1)濃度為2μg/ml的M2蛋白刺激24h時,U937細(xì)胞表面TLR4陽性表達(dá)率即有顯著增高,但并無濃度依賴性。2)濃度為50μg/ml的M2蛋白刺激U937細(xì)胞1h,細(xì)胞質(zhì)內(nèi)IκB即顯著減少,甚至消失;至2h,I-κB又逐漸增加,但仍明顯少于空白對照;至4h,I-κB已恢復(fù)至空白對照水平。以TLR4單克隆抗體HTA125阻斷TLR4通路后,再以濃度為50μg/ml的M2蛋白刺激U937細(xì)胞1h、2h,I-κB較阻斷前顯著增加,但仍明顯低于空白對照;至4h,阻斷后較阻斷前無明顯變化。濃度為50μg/ml的線粒體M2蛋白刺激U937細(xì)胞1h、2h和4h,均未檢測到pJNK。濃度為50μg/ml的線粒體M2蛋白刺激U937細(xì)胞1h,NF-κB活性即顯著增加;至2h,又逐漸降低;至4h,已明顯降低。以HTA125阻斷TLR4通路后,再以濃度為50μg/ml的線粒體M2蛋白刺激U937細(xì)胞1h、2h和4h,NF-κB活性較阻斷前顯著降低,尤其是刺激4h時,細(xì)胞核內(nèi)已基本檢測不出具有結(jié)合DNA活性的NF-κB。3)濃度為50μg/ml的M2蛋白刺激U937細(xì)胞24h,TNF-α和sTRAIL濃度顯著高于空白對照,IL-12與空白對照無明顯差異;至48h,TNF-α、IL-12和sTRAIL的濃度均較24h顯著增加;至72h,TNF-α和sTRAIL濃度較48h無顯著變化,IL-12濃度較48h顯著增加。以HTA125阻斷TLR4通路后,各時間點三種細(xì)胞因子的濃度均較阻斷前顯著降低。與此相似,以PDTC阻斷NF-κB后,各時間點三種細(xì)胞因子的濃度均較阻斷前顯著降低。 本部分研究結(jié)果表明,線粒體M2蛋白可以上調(diào)單核細(xì)胞TLR4的表達(dá),通過活化TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路并以NF-κB依賴途徑促進(jìn)單核細(xì)胞分泌TNF-α、IL-12和sTRAIL等細(xì)胞因子,直接損傷HIBEC或調(diào)節(jié)其它免疫細(xì)胞殺傷HIBEC,引起PBC發(fā)病。
【圖文】：

只J[E]:千而下護(hù)1‘0，1’護(hù)1’護(hù)圖1一 1FCM檢測外周血白細(xì)胞TLR4蛋白表達(dá)結(jié)果。A為淋巴細(xì)胞群，E為單核細(xì)胞群，，F(xiàn)為中性粒細(xì)胞群錄60水*** ...PBCCC口口乙肝后肝硬化化口口健康對照 照0

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