【摘要】：研究表明,長雙鏈RNA會引發(fā)干擾素(interferon ,IFN)防御途徑的激活,從而激活雙鏈RNA依賴蛋白激酶(Double-stranded RNA-dependent protein kinase, PKR),使其與長雙鏈RNA結(jié)合形成二聚體,一方面磷酸化真核細(xì)胞翻譯起始因子(eukaryotic Initiation Factor-2 alpha,eIF-2α),抑制蛋白質(zhì)合成,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡;另一方面,磷酸化轉(zhuǎn)錄因子NF-KappaB的抑制因子,使NF-KappaB活化,引起IFN相關(guān)刺激因子啟動子激活,導(dǎo)致IFN轉(zhuǎn)錄增加。為研究長雙鏈RNA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制,我們以長雙鏈RNA、短雙鏈RNA分別轉(zhuǎn)染HepG2.215細(xì)胞后,定量RT-PCR檢測干擾素表達(dá)、DNA Fragmentation ELISA檢測凋亡。結(jié)果表明,長雙鏈RNA使細(xì)胞中IFN表達(dá)水平上調(diào),凋亡增加,而短雙鏈RNA不會引起IFN水平的上調(diào)和凋亡。 RNA干擾(RNA Interference,RNAi)是指內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA( Double- stranded RNA, dsRNA)在細(xì)胞內(nèi)特異性的降解同源mRNA,致靶基因的表達(dá)沉默。dsRNA進(jìn)入細(xì)胞,在Dicer的切割下生成21-23nt的短鏈dsRNA,即小干擾RNA(Small Interfering RNA, siRNA),隨后結(jié)合核酶復(fù)合物形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA induced silencing complex,RISC ),RISC識別同源性的mRNA并將其降解。我們選取長雙鏈RNA(即dsRNA)、短雙鏈RNA(即siRNA)轉(zhuǎn)染HepG2.215細(xì)胞,ELISA測得細(xì)胞上清中HBsAg和HBeAg的含量,與對照組相比,HBsAg、HBeAg含量降低,說明通過RNAi可以抑制HBV的復(fù)制。 在前述的轉(zhuǎn)染過程中我們發(fā)現(xiàn),細(xì)胞貼壁更緊密時,后續(xù)轉(zhuǎn)染過程測定的凋亡率低于貼壁不緊密的細(xì)胞組。因此,我們推測細(xì)胞的黏附強(qiáng)弱不同會影響細(xì)胞的凋亡。為證實(shí)假設(shè),我們選用IFN、5-氟尿嘧啶分別誘導(dǎo)經(jīng)不同處理因素作用后的HepG2、HEK293細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),經(jīng)多聚賴氨酸預(yù)處理后的培養(yǎng)板,會增強(qiáng)細(xì)胞的貼壁生長能力,使細(xì)胞對藥物的敏感性下降,增殖抑制率、凋亡率均下降;而在細(xì)胞未貼壁時加入Fn抗體阻斷基質(zhì)中重要成分-纖維粘連蛋白(Fn)后,會使細(xì)胞對藥物的敏感性增加,增殖抑制率、凋亡率均上升;IFN作用不同黏附作用處理后的細(xì)胞組,Western檢驗(yàn)其PKR水平均升高,但組間無明顯差異。 綜合前述各項(xiàng)研究和我們的實(shí)驗(yàn)可得出:1.dsRNA會激活PKR系統(tǒng),引起細(xì)胞的凋亡,又能介導(dǎo)RNAi,抑制HBV的復(fù)制2.siRNA不能激活PKR系統(tǒng),也不引起細(xì)胞的凋亡,但能介導(dǎo)RNAi,抑制HBV的復(fù)制。3.干擾細(xì)胞-基質(zhì)的黏附作用可以增強(qiáng)IFN、5-氟尿嘧啶的敏感性,從而使細(xì)胞增殖受抑,凋亡增加。4.IFN可以增強(qiáng)PKR的磷酸化水平,但并不受黏附作用的影響。
【圖文】：

2-1-1 HBs 單鏈 RNA 正義鏈和反義鏈的合成(800bp)Figure2-1-1 Reaction to generate senseand antisense HBs-ssRNALane1 RNA markerLane2 sense ssRNALane3 antisense ssRNA圖2-1-2 LacZ單鏈RNA正義鏈的合成(1000bp)Figure2-1-2 Reaction to geneand antisense LacZ-ssRNLane1 RNA markeLane2 sense ssRNALane3 antisense ssRNeal-time RT-PCR 檢測 dsRNA 轉(zhuǎn)染的 HepG2.215 細(xì)胞mRNA 的表達(dá)水平eal-time RT-PCR 檢測顯示：HBs-dsRNA 轉(zhuǎn)染組、LacZ-dsRNA 轉(zhuǎn)染達(dá)量分別是空白轉(zhuǎn)染組的 3.15 倍和 3. 54 倍，呈顯著上調(diào)。3.63.73.8evelsl

2-1-1 HBs 單鏈 RNA 正義鏈和反義鏈的合成(800bp)Figure2-1-1 Reaction to generate senseand antisense HBs-ssRNALane1 RNA markerLane2 sense ssRNALane3 antisense ssRNA圖2-1-2 LacZ單鏈RNA正義鏈的合成(1000bp)Figure2-1-2 Reaction to geneand antisense LacZ-ssRNLane1 RNA markeLane2 sense ssRNALane3 antisense ssRNeal-time RT-PCR 檢測 dsRNA 轉(zhuǎn)染的 HepG2.215 細(xì)胞mRNA 的表達(dá)水平eal-time RT-PCR 檢測顯示：HBs-dsRNA 轉(zhuǎn)染組、LacZ-dsRNA 轉(zhuǎn)染達(dá)量分別是空白轉(zhuǎn)染組的 3.15 倍和 3. 54 倍，，呈顯著上調(diào)。3.63.73.8evelsl
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R512.62

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2661958