發(fā)布時間：2020-05-13 12:23

【摘要】：肝細(xì)胞癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC)是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤,但是目前為止除手術(shù)切除外,缺乏有效的防治手段。而且HCC的早期診斷率、早期發(fā)現(xiàn)率很低,臨床上大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已處于疾病的中晚期,失去了早期治療的機(jī)會。因此,如何對HCC有效的治療和盡早的預(yù)防一直以來都是研究的熱點(diǎn)與難題。肝纖維化是慢性肝病的病理基礎(chǔ),而HCC往往在慢性肝病的基礎(chǔ)上發(fā)展而來,因此肝纖維化也是HCC的重要病理基礎(chǔ)。HCC及肝硬化均是肝臟病變進(jìn)展到不可逆階段,但是肝纖維化階段是可逆的,如果有效阻斷甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化,則慢性肝病、肝硬化及HCC便可獲得良好的預(yù)防效果。microRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有著重要作用,超過1/3的人類蛋白編碼基因均受microRNA的調(diào)控。并且已有的研究顯示,microRNA能夠反映出疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的分子本質(zhì),能夠運(yùn)用于疾病的發(fā)病機(jī)制研究、診斷、分子分型、治療及預(yù)后的判斷,具有極大的研究潛力。同時運(yùn)用microRNA與mRNA對接研究的方法可以大大提高microRNA靶基因預(yù)測的準(zhǔn)確性,便于尋找目的靶基因。本課題分別從HCC的早期預(yù)防——探討肝纖維化發(fā)病機(jī)制的角度以及探索HCC新的治療方法角度,運(yùn)用microRNA或mRNA表達(dá)譜篩選的方法,對差異表達(dá)的RNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析,為HCC的早期預(yù)防及有效治療提供新的依據(jù)。本研究分二個部分。第一部分:肝竇內(nèi)皮細(xì)胞毛細(xì)血管化相關(guān)的microRNA及靶基因研究目的:篩選出在肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(LSEC)毛細(xì)血管化過程中差異表達(dá)的mRNA和microRNA,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析,根據(jù)分析結(jié)果挑選靶基因進(jìn)行組織學(xué)驗(yàn)證,為深入探討肝竇內(nèi)皮毛細(xì)血管化的關(guān)鍵基因提供前期依據(jù)。方法:體外持續(xù)培養(yǎng)人原代肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(HHSEC),在掃描電鏡下觀察培養(yǎng)過程中窗孔結(jié)構(gòu)的維持情況。根據(jù)窗孔的有無進(jìn)行分組,隨后提取mRNA進(jìn)行mRNA及microRNA表達(dá)譜芯片研究,將研究結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析及對接研究,挑選差異明顯的靶基因進(jìn)行臨床大樣本驗(yàn)證。結(jié)果:通過體外培養(yǎng)HHSEC的方法可以觀察到窗孔結(jié)構(gòu)由有至無的變化,我們提取相應(yīng)mRNA進(jìn)行mRNA和microRNA表達(dá)譜芯片。mRNA表達(dá)譜芯片結(jié)果顯示,1639個基因出現(xiàn)表達(dá)上調(diào)、1608個基因表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)。其中,有532個mRNA差異顯著。microRNA表達(dá)譜芯片篩選出了與HHSEC毛細(xì)血管化相關(guān),P0.05,差異顯著的microRNA共19個,其中表達(dá)上調(diào)的microRNA共7個,表達(dá)下調(diào)的microRNA共12個,并通過生物信息學(xué)分析方法獲得了 10109個靶基因信息。進(jìn)一步將mRNA與microRNA研究結(jié)果進(jìn)行對接分析,結(jié)果獲得253個共同的靶基因。根據(jù)這253個靶基因差異倍數(shù)大小挑選出差異顯著的一個——CALM2進(jìn)行臨床組織樣本免疫組化驗(yàn)證,結(jié)果顯示CALM2在LSEC的表達(dá)水平與肝纖維化的程度成正比,證實(shí)該靶基因與肝纖維化有關(guān)。結(jié)論:結(jié)合HHSEC mRNA及microRNA表達(dá)譜芯片篩選及生物學(xué)分析結(jié)果獲得與HHSEC毛細(xì)血管化相關(guān)的靶基因,并證實(shí)該靶基因的蛋白表達(dá)與肝纖維化程度成正比,為深入探討肝纖維化發(fā)病機(jī)制及逆轉(zhuǎn)措施提供了有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。第二部分:調(diào)控肝細(xì)胞癌中Glypican-3表達(dá)的microRNA研究目的:篩選出HCC中與Glypican-3(GPC3)表達(dá)相關(guān)的microRNA,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析,根據(jù)分析結(jié)果挑選差異顯著的microRNA進(jìn)行組織學(xué)驗(yàn)證,為深入探討GPC3在HCC表達(dá)的發(fā)生機(jī)制提供RNA依據(jù)。方法:將有完整臨床病理學(xué)資料的HCC樣本進(jìn)行GPC3組織學(xué)免疫組化及mRNA檢測,并據(jù)此分為GPC3陽性組和GPC3陰性組,進(jìn)行microRNA表達(dá)譜芯片研究。將研究結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析,挑選差異明顯的microRNA進(jìn)行臨床擴(kuò)大樣本驗(yàn)證。結(jié)果:根據(jù)GPC3表達(dá)情況進(jìn)行分組后,microRNA表達(dá)譜芯片篩選出信號值500共有25個差異表達(dá)的microRNA,其中10個microRNA表達(dá)上調(diào),15個microRNA表達(dá)下調(diào)。隨后挑選出5個microRNA進(jìn)一步qPCR擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證,成功篩選出了 4個差異表達(dá)microRNA(miR-99a-5p,miR-125b-5p,miR-376c-3p,miR-17-5p),并通過生物信息學(xué)分析方法獲得了相關(guān)的GO和信號通路信息。結(jié)論:運(yùn)用microRNA表達(dá)譜芯片和qPCR擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證的方法成功篩選出了 HCC中GPC3相關(guān)的microRNA,并通過生物信息學(xué)分析為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。結(jié)論:肝纖維化及HCC的形成過程中有大量microRNA和靶基因的共同參與,我們通過microRNA或mRNA表達(dá)譜分析,篩選出了在各自過程中差異顯著的microRNA及mRNA,并利用生物信息學(xué)分析方法獲得了相關(guān)靶基因和信號通路信息,同時進(jìn)行臨床驗(yàn)證,為深入研究提供前期基礎(chǔ)。
【圖文】：

注：ＣＰ－１、ＣＰ－２代表原代ＨＨＳＥＣ；邋Ｃｈｈｌ、Ｃｈｈ２代表培養(yǎng)３周后的ＨＨＳＥＣ。逡逑２．２邋ＨＨＳＥＣ邋ＲＮＡ完整性分析逡逑瓊脂糖凝膠電泳觀結(jié)果（圖１．２）見３條電泳條帶，由上向下依次為２８Ｓ、１８Ｓ核逡逑糖體ＲＮＡ及低分子量ＲＮＡ。２８Ｓ和１８Ｓ核糖體ＲＮＡ條帶明顯、銳利，提示各組逡逑ＨＨＳＥＣ邋ＲＮＡ完整性較好，符合芯片實(shí)驗(yàn)要求。逡逑ＣＰ－１邋ＣＰ－２邐Ｃｂｈ．１邐Ｃｈｈ２逡逑■逡逑■Ｂｒ逡逑圖１．２邋ＨＨＳＥＣ邋ＲＮＡ電泳結(jié)果圖（標(biāo)記代表的組別見前）逡逑３．邋ＨＨＳＥＣ邋Ａｇｉｌｅｎｔ全基因組芯片及ｍｉｃｒｏＲＮＡ芯片雜交逡逑ＨＨＳＥＣ邋Ａｇｉｌｅｎｔ表達(dá)譜芯片及ｍｉｃｒｏＲＮＡ表達(dá)譜芯片由Ｇｅｎｅｐｉｘ邋４０００Ｂ焚光掃描逡逑２１逡逑

華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文逡逑儀掃描后，生成ＴＩＦＦ格式圖片。每個樣本重復(fù)３次（圖１．３）。結(jié)果良好。逡逑ＣＰ－１逡逑ＣＰ－２逡逑Ｃｈｈｌ逡逑Ｃｈｈ２逡逑２２逡逑
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R575.2;R735.7

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本文編號：2661953