發(fā)布時間：2020-05-13 00:12

【摘要】：研究背景與目的 肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展到肝硬化必經(jīng)的病理改變。肝星狀細胞(hepatic stellate cell, HSC)是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵細胞。目前研究認為靜息型HSC激活轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨虷SC，是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)。因此，肝星狀細胞活化機制是目前肝纖維化防治的一個研究熱點。microRNA是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小長約20~25個核苷酸。microRNA通過堿基互補配對的方式識別靶基因mRNA，并根據(jù)互補程度的不同降解靶基因mRNA或者阻遏靶基因mRNA的翻譯。microRNA參與多種生物調(diào)節(jié)途徑，包括器官發(fā)育、病毒防御、造血過程、器官形成、細胞增殖和凋亡、脂肪代謝等等。目前國內(nèi)外關(guān)于microRNA在肝星狀細胞活化過程中調(diào)節(jié)作用的報道還很少。因此，本論文研究目的旨在研究microRNA在肝星狀細胞活化過程中的調(diào)節(jié)作用，以深入闡明肝纖維化發(fā)病機制中microRNA的重要性，也為肝纖維化的早期干預提供新的思路。 本研究通過分離大鼠原代肝星狀細胞和構(gòu)建DMN大鼠肝纖維化模型，應用高通量microRNA芯片技術(shù)，對肝星狀細胞活化過程(靜息狀態(tài)—半活化狀態(tài)—完全活化狀態(tài))和DMN肝纖維化模型肝纖維化各期肝組織(S0—S4期)進行microRNA譜檢測，篩選并驗證與肝纖維化相關(guān)的microRNA；miR-335證實在肝星狀細胞活化過程中顯著降低，通過構(gòu)建miR-335過表達慢病毒載體，研究miR-335對肝星狀細胞增殖、活化與遷移功能的影響，并探討其可能的機制。研究共分三個部分：⑴大鼠肝星狀細胞的分離鑒定與培養(yǎng)；⑵肝星狀細胞活化過程(靜息狀態(tài)-半活化狀態(tài)-完全活化狀態(tài))和DMN肝纖維化模型肝纖維化各期肝組織(S0-S4期) microRNA芯片譜其生物信息學分析；⑶miR-335過表達慢病毒載體抑制肝星狀細胞活化與遷移及其相關(guān)機制研究。 方法 一、 HSC的分離培養(yǎng)與鑒定 雄性Sprague-Darwley大鼠(400g-600g)，分離門靜脈并插管，，采用酶消化—密度梯度離心法，依次灌注鏈酶蛋白酶—膠原酶，37℃原位消化，12%Nycodenz密度梯度離心獲得HSC，含10%胎牛血清(FBS)的DMEM中培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)液。328nm紫外光下觀察HSC自發(fā)熒光，細胞免疫熒光檢測細胞Desmin與α-SMA表達，real-time PCR檢測細胞TypeⅠcollagen與α-SMA表達，鑒定HSC純度。 二、肝星狀細胞活化過程(靜息狀態(tài)—半活化狀態(tài)—完全活化狀態(tài))和DMN肝纖維化模型肝纖維化各期肝組織(S0—S4期) microRNA芯片譜及其生物信息學分析 (一)肝星狀細胞活化各期microRNA芯片譜及生物信息學分析HSC活化各期microRNA芯片檢測：肝星狀細胞體外培養(yǎng)2天(d2)作為靜息狀態(tài)HSC；培養(yǎng)7天(d7)作為半活化狀態(tài)狀態(tài)HSC；培養(yǎng)14天(d14)作為完全活化狀態(tài)HSC。差異microRNA生物信息學分析：Gene ontology (GO)分析—應用GO分析軟件對差異microRNA進行功能分析，得到可能的富集功能，尋找差異microRNA可能與哪些基因功能改變相關(guān)；pathway分析—基于KEGG等數(shù)據(jù)庫，得到顯著富集的生物信號通路或者代謝通路，尋找差異microRNA可能與哪些細胞通路改變相關(guān)。 (二) DMN肝纖維化動物模型構(gòu)建、各期肝纖維化組織microRNA芯片譜及生物信息學分析DMN肝纖維化動物模型構(gòu)建及肝纖維化各期肝組織microRNA芯片檢測：1%DMN(10ug/kg)每周連續(xù)三天腹腔注射，連續(xù)四周。每周處死一批大鼠，進行肝組織病理檢測及肝功能檢測。差異microRNA生物信息學分析：Gene ontology (GO)分析、pathway分析和microRNA-gene-network。 三、 miR-335過表達慢病毒載體抑制肝星狀細胞活化與遷移及其相關(guān)機制研究 (一) miR-335過表達慢病毒載體的構(gòu)建及驗證miR-335過表達慢病毒載體的構(gòu)建：將miR-335前體結(jié)構(gòu)插入pLV-CMV-MCS-GFP-FLAG miRNA表達載體(pLV-miR-335)，然后進行病毒質(zhì)粒的包裝、擴增與濃縮，最后形成有效的miR-335過表達慢病毒載體；miR-335過表達慢病毒載體有效性驗證：以不同MOI值(MOI取5到50)將miR-335過表達慢病毒載體轉(zhuǎn)染HSC，應用熒光顯微鏡評估其轉(zhuǎn)染效率，然后應用real-time PCR的方法檢測轉(zhuǎn)染前后miR-335表達水平變化。 (二) HSC增殖的檢測在96孔培養(yǎng)皿內(nèi)按1×106cells/ml密度種植原代HSC，無血清DMEM同步化24小時，miR-335過表達慢病毒載體轉(zhuǎn)染細胞3-4天后，應用CCK-8試劑盒檢測細胞增殖率。 (三) HSC細胞遷移的檢測 1、劃痕實驗：在6孔培養(yǎng)皿內(nèi)按1×105cells/ml密度種植HSC，無血清培養(yǎng)基同步化24小時，miR-335過表達慢病毒載體轉(zhuǎn)染細胞3-4天后，用Tip(100ul)尖端同一方向垂直劃痕，分別在12h和36h后顯微鏡下拍照，計算細胞遷移率＝(作用前劃痕內(nèi)面垂直距離－作用后劃痕內(nèi)面垂直距離)/作用前劃痕內(nèi)面垂直距離×100％。 2、Transwell：在24孔板Transwell小室中按1×104cells/well密度種植HSC，無血清DMEM同步化24小時，miR-335過表達慢病毒載體轉(zhuǎn)染細胞3-4天后，用500ul含20%FBS的培養(yǎng)基趨化HSC24小時，結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下隨機選取5個視野計算遷移細胞數(shù)目。 (四) HSC活化的檢測 1、應用real-time PCR的方法檢測肝星狀細胞TypeⅠcollagen與α-SMA mRNA水平的表達； 2、應用Western Blot的方法檢測肝星狀細胞TypeⅠcollagen與α-SMA蛋白水平的表達。 四、統(tǒng)計學分析數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，數(shù)據(jù)由SPSS16.0軟件統(tǒng)計包處理。多組間的比較用One-WayANOVA方差分析。P0.05認為有統(tǒng)計學差異。 結(jié)果 一、原代大鼠HSC的分離與鑒定 1、328nm紫外光下自發(fā)熒光及Desmin、α-SMA細胞免疫熒光檢測靜息與活化HSC細胞純度達95%以上，能滿足實驗需要。 2、應用real-time PCR檢測體外培養(yǎng)2天、7天以及14天的HSC活化標志物TypeⅠcollagen與α-SMA mRNA的表達。與2天相比，TypeⅠcollagen與α-SMAmRNA在7天時輕度升高，在14天時顯著增加，因此，將HSC2d作為靜息狀態(tài)HSC，7d作為半活化狀態(tài)HSC，14d作為完全活化狀態(tài)HSC。 二、DMN肝纖維化動物模型構(gòu)建隨著DMN給藥時間的延長，肝功能逐漸降低，肝纖維化程度逐漸加重，至第四周給藥后，已能觀察到明顯的肝硬化甚至伴有失代償癥狀(出現(xiàn)腹水)。根據(jù)肝組織病理結(jié)果，DMN給藥第一周作為肝纖維化S1期，給藥第二周作為肝纖維化S2期，給藥第三周作為肝纖維化S3期，給藥第四周作為肝纖維化S4期。 三、肝星狀細胞活化各期microRNA芯片譜及生物信息學分析 1、17個microRNA (miR-345-5p、miR-152、miR-199a-5p、miR-218、miR-125b-5p、miR-214、miR-34c、miR-34b、miR-199a-3p、miR-425、miR-221、miR-301a、miR-222、miR-193、miR-31、miR-143、miR-145)在肝星狀細胞活化過程中表達逐漸升高；14個microRNA(miR-101a、miR-335、miR-877、miR-139-5p、miR-150、miR-126*、miR-192、miR-450a、rno-miR-497、rno-miR-338、rno-miR-10a-5p、rno-miR-378*、rno-miR-195、miR-126)在肝星狀細胞活化過程中表達逐漸降低。 2、生物信息學分析： (1)GO分析：28個GOs被肝星狀細胞活化過程中上調(diào)的microRNA調(diào)節(jié)，31個GOs被肝星狀細胞活化過程中下調(diào)的microRNA調(diào)節(jié)； (2)GO-Map分析：GO-Map顯示最主要的GOs為神經(jīng)元分化、信號轉(zhuǎn)導、囊泡介導的運輸、細胞處理、細胞分化、細胞增殖正向調(diào)控、應激反應、G蛋白偶聯(lián)受體信號通路、蛋白質(zhì)氨基酸磷酸化以及細胞遷移； (3)pathway分析：Phosphatidylinositol signaling system、Wnt signaling pathway、mTOR signalingpathway、Focal adhesion、ECM-receptor interaction、Notch signaling pathway、T cellreceptor signaling pathway、TGF-beta signaling pathway、Regulation of actincytoskeleton、Insulin signaling pathway、MAPK signaling pathway、VEGF signalingpathway、Hedgehog signaling pathway等可能被肝星狀細胞活化過程中上調(diào)的microRNA所調(diào)節(jié)； TGF-beta signaling pathway、mTOR signaling pathway、Wnt signaling pathway、Adherens junction、Non-small cell lung cancer、Pancreatic cancer、Bladder cancer、Phosphatidylinositol signaling system、Prostate cancer、Glioma、SNARE interactionsin vesicular transport、O-Glycan biosynthesis、Hedgehog signaling pathway、Focaladhesion、VEGF signaling pathway、MAPK signaling pathway、Insulin signalingpathway等可能被肝星狀細胞活化過程中下調(diào)的microRNA所調(diào)節(jié)。 四、DMN肝纖維化模型肝纖維化各期肝組織(S0-S4期) microRNA芯片譜及其生物信息學分析 1、10個microRNA (miR-34b、miR-34c、miR-34a、miR-221、miR-146b、miR-214、miR-199a-5p、miR-199a-3p、miR-223、miR-324-5p)在肝纖維化過程中表達逐漸升高；5個microRNA (miR-878、miR-193、miR-378、miR-92a、miR-19a)在肝纖維化過程中表達逐漸降低。 2、生物信息學分析(GO分析和pathway分析)： (1)GO分析：15個GOs被肝纖維化過程中表達上調(diào)的microRNA調(diào)節(jié)，10個GOs被肝纖維化過程中表達下調(diào)的microRNA調(diào)節(jié)。 (2)pathway分析：Glycerophospholipid metabolism、Pyruvate metabolism、Lysine degradation、Proteasome、Reductive carboxylate cycle (CO2fixation)、Benzoate degradation viaCoA ligation、Riboflavin metabolism、Focal adhesion、PPAR signaling pathway、MAPK signaling pathway、mTOR signaling pathway等可能被肝纖維化過程中表達上調(diào)的microRNA調(diào)節(jié)；Butanoate metabolism、Arginine and proline metabolism、Cell cycle、Glioma、Insulinsignaling pathway、MAPK signaling pathway、Focal adhesion、Regulation of actincytoskeleton、ECM-receptor interaction、Fatty acid metabolism、TGF-beta signalingpathway等可能被肝纖維化過程中表達下調(diào)的microRNA調(diào)節(jié)。 (3) microRNA-gene-network分析：得到網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵的microRNA以及被調(diào)控最多的靶基因。 五、miR-335過表達慢病毒載體構(gòu)建及驗證 1、應用real-time PCR技術(shù)證實，miR-335、miR-150的表達在HSC活化過程中顯著下調(diào)，miR-221、miR-143、miR-145的表達在HSC活化過程中顯著上調(diào)，與芯片檢測結(jié)果符合。 2、選取miR-335進行功能研究，構(gòu)建miR-335過表達慢病毒載體，MOI值為50時，miR-335過表達慢病毒載體HSC轉(zhuǎn)染效率達90%以上，real-time PCR檢測miR-335過表達慢病毒載體轉(zhuǎn)染HSC后miR-335的表達量增加175倍，恢復到靜息狀態(tài)HSC水平，證實miR-335過表達慢病毒載體構(gòu)建成功。 六、miR-335過表達慢病毒載體對HSC活化的影響 miR-335過表達慢病毒載體轉(zhuǎn)染HSC后明顯抑制HSC活化標志物TypeⅠcollagen與α-SMA mRNA和蛋白的表達(P0.05)。real-time PCR和Westernblot結(jié)果顯示，α-SMA mRNA和蛋白的表達被miR-335過表達分別抑制了70%和31%；TypeⅠcollagen mRNA和蛋白表達分別被抑制了53%和20%。 七、miR-335過表達慢病毒載體對HSC遷移的影響 1、Transwell結(jié)果顯示，miR-335過表達抑制HSC遷移的40%(P0.05)； 2、細胞劃痕實驗結(jié)果顯示，miR-335過表達抑制HSC遷移的45%(P0.05)。 八、miR-335過表達慢病毒載體對HSC增殖的影響正常組、陰性對照組、miR-335過表達組三組細胞應用CCK-8法檢測細胞增殖率，連續(xù)監(jiān)測5天，三組細胞增殖率之間無統(tǒng)計學差異。 九、miR-335過表達慢病毒載體對TNC表達的影響 1、TNC mRNA和蛋白的表達量在HSC活化過程中顯著升高； 2、miR-335過表達顯著降低TNC mRNA和蛋白的表達量。real-time PCR和Western blot結(jié)果顯示，TNC mRNA和蛋白的表達量分別被抑制了76%和74%。 十、TNC對HSC遷移功能的影響 給予外源性TNC (20ug/ml; CC115; Chemicon)，HSC增值率未見明顯改變，但HSC遷移率提高50%。 結(jié)論 一、在肝星狀細胞活化過程中，17個microRNA在肝星狀細胞活化過程中表達逐漸升高，14個microRNA在肝星狀細胞活化過程中表達逐漸降低；在肝纖維化進展中，10個microRNA在肝纖維化過程中表達逐漸升高；5個microRNA在肝纖維化過程中表達逐漸降低。生物信息學分析顯示，多個和肝纖維化發(fā)生密切相關(guān)的基因功能以及細胞信號轉(zhuǎn)導通路如細胞遷移、TGF-beta signaling pathway、VEGF signaling pathway等等均受到這些肝纖維化相關(guān)microRNA的調(diào)控，提示microRNA可能在細胞和組織層面上都參與了肝纖維化發(fā)生發(fā)展的調(diào)控。二、miR-335的表達量在肝星狀細胞活化過程中顯著降低，miR-335過表達顯著抑制肝星狀細胞的活化及遷移，可能是通過下調(diào)TNC的表達量而實現(xiàn)。
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R575.2

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 姚定康,李石,孔憲濤,葉挺軍;腱蛋白在四氯化碳大鼠肝纖維化形成過程中的動態(tài)表達[J];中華肝臟病雜志;2002年01期

2 陳超;陳寧;覃霞;朱j;;一種改良的肝星狀細胞分離方法[J];胃腸病學和肝病學雜志;2011年06期

本文編號：2661050