發(fā)布時(shí)間：2020-05-12 02:12

【摘要】：研究背景和意義 遺傳性出血性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥(Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia, HHT)亦稱Osler-Weber-Rendu病,是一種由轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (Transforming Growth Factor β, TGF-β)信號(hào)通路相關(guān)基因突變導(dǎo)致血管形成發(fā)育障礙而引起的涉及鼻、口腔、唇、舌、四肢等全身皮膚粘膜以及肝、肺、腦、胃腸道等內(nèi)臟器官的全身性疾病。該病屬于常染色體顯性遺傳病,但不完全外顯,存在散發(fā)性病例,其純合子病人尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道,雜合子病人因“單倍劑量不足”出現(xiàn)隨年齡增長(zhǎng)而不斷進(jìn)展的病癥�；颊叩陌l(fā)病情況、受累臟器、臨床表現(xiàn)及預(yù)后存在較大的個(gè)體間差異,給該病的早期臨床診斷和治療造成困難。2002年日本秋田縣(人口約120萬(wàn))開展了HHT的流行病學(xué)調(diào)查,結(jié)果顯示當(dāng)?shù)卦摬〉陌l(fā)病率為1/8000-1/5000,與歐美國(guó)家相比較,亞洲尤其東亞地區(qū)或許是HHT的高發(fā)區(qū)域。 上世紀(jì)八十、九十年代,國(guó)外開展的病例回顧性研究表明HHT肝臟受累的比例為8-31%。然而,隨著影像技術(shù)的進(jìn)步和篩查方法的改進(jìn),近年來(lái)肝臟受累的病例報(bào)道逐漸增多,而HHT肝臟受累的比例也不斷增高。2004年,Buscarini利用彩超對(duì)64個(gè)HHT家系進(jìn)行肝臟篩查,發(fā)現(xiàn)41.4%的HHT患者存在肝血管畸形；而非家系選擇性隊(duì)列研究中,影像學(xué)篩查發(fā)現(xiàn)67%-84%的HHT患者病變累及肝臟,其中Buonamico于2008年報(bào)道的肝臟受累比例高達(dá)84%。因此,HHT肝臟受累的相關(guān)研究必然地成為了HHT研究的重要部分,而“肝臟遺傳性出血性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥(Hepatic Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia, HHHT)"的概念也逐漸被接受。 HHHT的大多數(shù)患者起初無(wú)明顯癥狀,亦無(wú)特異性體征,有癥狀而就診者比例不足15%,而具備充血性心力衰竭、門脈高壓、膽系癥狀等典型癥狀的患者更少,容易漏診、誤診。有學(xué)者提出了診斷HHT的經(jīng)驗(yàn)性的"Curacao標(biāo)準(zhǔn)”,但具體到肝臟(即HHHT),其特異性、敏感性受到質(zhì)疑,臨床指導(dǎo)意義有限。影像學(xué)檢查方面,作為血管畸形診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”的血管造影逐漸被無(wú)創(chuàng)性檢查技術(shù)取代,但該病彩超、CT的診斷標(biāo)準(zhǔn)尚未統(tǒng)一。國(guó)外HHHT相關(guān)的基因檢查已開展,然而,不同致病位點(diǎn)被陸續(xù)發(fā)現(xiàn),且有新的致病基因被報(bào)道(如MADH4基因)。由于其家族特異性遺傳特點(diǎn),對(duì)于未知突變基因的病人以及無(wú)家族遺傳背景的患者,基因診斷困難。因此,HHHT的臨床診斷策略有待進(jìn)一步完善。 與此同時(shí),HHHT的治療方案,尤其外科治療也沒有達(dá)成共識(shí),值得深入探討。廣義的HHHT外科治療主要包括肝動(dòng)脈介入栓塞、肝動(dòng)靜脈瘺結(jié)扎、縮扎術(shù)、肝移植術(shù)。介入治療利用栓塞劑或不銹鋼圈栓塞動(dòng)靜脈瘺的供血血管,具有創(chuàng)傷小、顯效快特點(diǎn),但隨訪發(fā)現(xiàn)術(shù)后易復(fù)發(fā),且能引起膽道甚至肝組織缺血壞死。肝動(dòng)靜脈瘺結(jié)扎及擴(kuò)張的動(dòng)脈瘤結(jié)扎術(shù),手術(shù)創(chuàng)傷較大,術(shù)后并發(fā)癥較多,部分患者術(shù)后也出現(xiàn)局部肝組織和膽道缺血壞死。2006年《Annal of Surgery》總結(jié)了1985年-2003年歐洲14個(gè)醫(yī)療中心開展的40例HHHT肝移植的情況：60%出現(xiàn)移植后并發(fā)癥；20%移植后死亡；另有2例疑似復(fù)發(fā)。 近年來(lái),國(guó)內(nèi)相關(guān)肝臟遺傳性出血性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥(HHHT)報(bào)道逐漸增多,但遺憾的是,國(guó)內(nèi)尚無(wú)較為系統(tǒng)的病例分析和臨床研究。針對(duì)國(guó)內(nèi)HHHT的系統(tǒng)臨床病例研究的空白及診斷方法和治療方式的爭(zhēng)議,我們課題組隨訪調(diào)查了山東濟(jì)南、淄博桓臺(tái)、聊城莘縣、臨沂蒙陰以及上海、浙江衢州、河南鄭州、河北石家莊等地的HHHT病例,采集了臨床資料和家系信息。本研究(第一部分)整理并回顧性分析了2002年-2011年山東大學(xué)齊魯醫(yī)院以及山東、河南、河北、浙江等地合作醫(yī)療單位診治的15例HHHT患者臨床資料,對(duì)HHHT的臨床表現(xiàn)、病理、診斷、治療及預(yù)后進(jìn)行總結(jié)、分析,初步提出了HHHT的診斷策略、個(gè)體化治療方案以及肝動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)式的改進(jìn)方法。 HHHT的遺傳學(xué)背景是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGF-β)受體超家族相關(guān)編碼基因的突變：HHT1型致病基因?yàn)镋NG(endoglin),位于9號(hào)染色體長(zhǎng)臂(9q33-34),編碼TGF-β的細(xì)胞表面協(xié)同受體endoglin;HHT2型致病基因?yàn)锳LK-1(activin receptor-like kinase1),位于12號(hào)染色體長(zhǎng)臂(12q13),編碼ALK-1(或ACVRL1),是TGF-βⅠ型受體的一種。ENG和ALK-1主要存在于內(nèi)皮細(xì)胞尤其血管內(nèi)皮細(xì)胞表面,在血管形成、發(fā)育方面具有重要作用。目前新發(fā)現(xiàn)其他4個(gè)基因與HHT相關(guān),其中除了5號(hào)染色體和7號(hào)染色體上的2個(gè)致病基因功能尚不明確外,MADH4基因和BMPR2基因都與TGF-β信號(hào)通路相關(guān),而位于18號(hào)染色體(18q21)的MADH4,編碼TGF-β受體的激酶底物——Smad4,對(duì)TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)具有重要作用。 TGF-β參與人體諸多生命過(guò)程的調(diào)控,如細(xì)胞生長(zhǎng)分化、胚胎發(fā)育、血管形成,而其信號(hào)通路的傳導(dǎo)異常可引發(fā)腫瘤、HHT等多種疾病。現(xiàn)代分子生物學(xué)研究已經(jīng)基本明確TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程,即當(dāng)TGF-β與其細(xì)胞表面受體TGF-β receptor, TβR)結(jié)合后,誘導(dǎo)受體TβR-Ⅰ, TβR-Ⅱ形成復(fù)合體,TβR-Ⅱ催化Tβ R-Ⅰ結(jié)構(gòu)域的絲氨酸/蘇氨酸殘基磷酸化,激活絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,從而活化TβR-Ⅰ,再作用于細(xì)胞內(nèi)底物,如SMAD家族,完成細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)。正是由于TGF-β細(xì)胞表面受體和細(xì)胞內(nèi)SMAD家族結(jié)構(gòu)和功能不同,激活或抑制基因表達(dá),使TGF-β產(chǎn)生不同生物學(xué)效應(yīng)。其中,Smad分為3類：即受體活化型(R-Smad)、共同通路型(Co-Smad)和抑制型(I-Smad)。R-Smad(包括Smad2、 Smad3)和Co-Smad(即Smad4)是TGF-β信號(hào)正常傳導(dǎo)所需介質(zhì)；而I-Smad(如Smad7)則能抑制TGF-β的信號(hào)傳導(dǎo)。ENG、ALK-1及MADH4基因的突變使TGF-β細(xì)胞表面相關(guān)受體及下游Smad4異常,阻礙了TGF-β正常信號(hào)傳導(dǎo),導(dǎo)致血管生成發(fā)育障礙,引發(fā)HHT。 因此,我們?cè)O(shè)想：增強(qiáng)TGF-β傳導(dǎo)通路,尤其增強(qiáng)TGF-β受體或Smad4功能的干預(yù)措施,或許能起到一定治療效果或延緩HHT的病情發(fā)展。我們嘗試尋找TGF-β通路的正性調(diào)控因子,而RNF11可能就是這樣一種調(diào)節(jié)蛋白。 環(huán)指蛋白11(Ring-Finger Protein11, RNF11)是最早由腫瘤cDNA文庫(kù)中克隆出來(lái)的具有環(huán)指結(jié)構(gòu)的蛋白,經(jīng)免疫共沉淀法發(fā)現(xiàn)其能與近80種不同類型和功能的細(xì)胞內(nèi)蛋白作用,并且發(fā)現(xiàn)其能通過(guò)自身直接作用及泛素化等間接作用調(diào)節(jié)TGF-β通路和表皮生長(zhǎng)因子(Epidermal Growth Factor, EGF)通路,被認(rèn)為是細(xì)胞信號(hào)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的交叉點(diǎn)。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是目前已知最重要的蛋白質(zhì)降解體系,參與基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、信號(hào)傳遞、細(xì)胞增殖、凋亡、分化等幾乎一切生命活動(dòng)的調(diào)控。而RNF11是一種包含多個(gè)結(jié)構(gòu)域的調(diào)節(jié)蛋白,其中包括一個(gè)泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域,能通過(guò)泛素化途徑對(duì)受體、轉(zhuǎn)錄因子、信號(hào)蛋白進(jìn)行調(diào)控。Smurf2(一種泛素化連接酶)是已知的TGF-β信號(hào)的高效負(fù)性調(diào)節(jié)因子：一方面能促進(jìn)Smad2降解而下調(diào)TGF-β信號(hào),另一方面能與Smad7作用以抑制TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)并促進(jìn)TGF-β受體降解。國(guó)外學(xué)者報(bào)道RNF11或許能通過(guò)阻斷Smurf2活性和直接增強(qiáng)Smad4活性的方式以增強(qiáng)TGF-β信號(hào)。 因此,我們選取環(huán)指蛋白11(RNF11)作為可能延緩HHHT病情發(fā)展或治療HHHT的因子。本研究(第二部分)中,我們成功構(gòu)建了RNF11過(guò)表達(dá)真核載體,通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法對(duì)體外肝細(xì)胞系(Chang Liver)的增殖進(jìn)行干預(yù),觀察RNF11是否能夠增強(qiáng)TGF-β1的增殖抑制能力,論證RNF11對(duì)TGF-β通路的正性調(diào)節(jié)作用,為我們課題組之后應(yīng)用TGF-β通路相關(guān)調(diào)節(jié)因子調(diào)控血管生成及治療HHHT相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究做前期準(zhǔn)備。 第一部分 肝臟遺傳性出血性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥的診斷策略和個(gè)體化治療 目的 總結(jié)肝臟遺傳性出血性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥(Hepatic Hereditary Hemorrhagic Telangiectasia, HHHT)的診治經(jīng)驗(yàn),探討其臨床診斷策略和治療方案。 方法 回顧性分析15例HHHT患者的臨床癥狀、體征、實(shí)驗(yàn)室檢查、組織病理學(xué)檢查、影像學(xué)檢查、治療方法和臨床效果及預(yù)后資料。 結(jié)果 1、HHHT早期無(wú)特異性臨床表現(xiàn),可出現(xiàn)上腹痛、貧血、氣短、肝區(qū)雜音等,但可能迅速進(jìn)展,出現(xiàn)門脈高壓、肝硬化、充血性心力衰竭等并發(fā)癥； 2、彩超、CT顯示肝內(nèi)彌漫性或局灶性毛細(xì)血管擴(kuò)張、動(dòng)靜脈瘺、肝動(dòng)脈迂曲擴(kuò)張甚至動(dòng)脈瘤形成；數(shù)字減影血管造影(DSA)對(duì)多支肝動(dòng)脈的復(fù)雜患者,血管顯影欠佳,而計(jì)算機(jī)斷層掃描血管造影(CTA)則顯示清晰； 3、組織病理學(xué)檢查示肝內(nèi)彌散性或局灶性毛細(xì)血管擴(kuò)張?jiān)钜约敖惶娉霈F(xiàn)的再生和萎縮,部分肝組織呈現(xiàn)“竇性擴(kuò)張”特點(diǎn)；局部出現(xiàn)灶性結(jié)節(jié)性增生及硬化樣改變；免疫組化染色顯示HHHT患者肝組織TGF-β1強(qiáng)陽(yáng)性； 4、手術(shù)6例,其中5例患者接受肝動(dòng)脈結(jié)/縮扎術(shù),隨訪效果滿意；血管介入治療3例,其中1例存在多支肝動(dòng)脈的復(fù)雜型患者介入栓塞失敗,藥物治療30月后病逝；4例僅行藥物治療,隨訪彩超、CT示肝臟病變逐漸加重；2例起始無(wú)癥狀,但21月、35月后分別出現(xiàn)肝功異常、腹水等癥狀,其中1例病逝。 結(jié)論 依據(jù)“充血性心力衰竭、門脈高壓、膽系病變”三項(xiàng)主要臨床表現(xiàn),參照家族史和累及其他臟器所導(dǎo)致的相應(yīng)癥狀和體征,以“肝內(nèi)毛細(xì)血管擴(kuò)張、動(dòng)靜脈瘺、肝動(dòng)脈迂曲擴(kuò)張或動(dòng)脈瘤形成”的影像學(xué)特征作為主要診斷指標(biāo)；而基因檢測(cè)、血清TGF-β1檢測(cè)可以作為輔助性診斷方法；肝臟組織病理學(xué)活檢應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎對(duì)待；HHHT為進(jìn)展性疾病,依據(jù)病變程度和發(fā)病階段,病人可以分為無(wú)癥狀型、簡(jiǎn)單型(肝動(dòng)脈單支型)和復(fù)雜型(肝動(dòng)脈多支型)三型；早期、積極的個(gè)體化治療具有較好的臨床效果；保留肝周韌帶及膽道供血的肝動(dòng)脈結(jié)/縮扎手術(shù)療效滿意。 意義 比較系統(tǒng)地總結(jié)和分析了HHHT病人的臨床特點(diǎn),在國(guó)內(nèi)率先提出了HHHT的診斷策略和個(gè)體化治療方案；針對(duì)單純肝動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)后引起肝組織及膽道缺血壞死的風(fēng)險(xiǎn),創(chuàng)新性地提出了預(yù)防性措施和改良術(shù)式,即1)嚴(yán)格控制手術(shù)適應(yīng)征,當(dāng)存在明顯門靜脈-肝靜脈瘺時(shí),避免施行肝動(dòng)脈結(jié)扎術(shù)；2)盡量不游離膽管、保留肝周韌帶及膽管血供；3)將結(jié)扎和縮扎術(shù)式結(jié)合(即肝動(dòng)脈結(jié)/縮扎術(shù)),避免單純結(jié)扎術(shù)后肝組織及膽道缺血壞死。 第二部分環(huán)指蛋白11(RNF11)與TGF-β傳導(dǎo)通路相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究 目的 探討環(huán)指蛋白11(Ring Finger Protein11, RNF11)通過(guò)TGF-β通路對(duì)Chang Liver肝細(xì)胞系增殖的作用,驗(yàn)證RNF11對(duì)TGF-β傳導(dǎo)通路的正性調(diào)控作用。 方法 通過(guò)PCR技術(shù)檢測(cè)Chang Liver正常肝細(xì)胞系、Hepg-2肝癌細(xì)胞系、A549肺腺癌細(xì)胞系中RNF11的表達(dá)情況；構(gòu)建并通過(guò)SgfⅠ單酶切法、SgfⅠ和MIuI雙酶切法以及DNA直接測(cè)序法鑒定RNF11真核表達(dá)載體pCMV6-RNF11-GFP;應(yīng)用TGF-β1對(duì)Chang Liver細(xì)胞增殖的濃度梯度實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化TGF-β1的給藥濃度；通過(guò)脂質(zhì)體法將PCMV6-RNF11-GFP載體及空載體轉(zhuǎn)染給Chang Liver細(xì)胞；轉(zhuǎn)染后24h,給予終濃度5ng/ml TGF-β1處理(由濃度梯度實(shí)驗(yàn)確定),在轉(zhuǎn)染后48h、72h、96h(即TGF-β1給藥后24h、48h、72h),對(duì)轉(zhuǎn)染組、空轉(zhuǎn)組、對(duì)照組分別用CCK-8法、Brdu-DAPI復(fù)染法及生長(zhǎng)曲線描述法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。 結(jié)果 1、Chang Liver細(xì)胞系表達(dá)RNF11； 2、CCK-8法及細(xì)胞生長(zhǎng)曲線示RNF11轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖趨緩,與相應(yīng)對(duì)照組及空轉(zhuǎn)組相比有顯著性差異(P0.05)； 3、RNF11轉(zhuǎn)染后48、72、96小時(shí)Chang Liver細(xì)胞增殖抑制率分別為10.80%、14.47%、16.31%,而相對(duì)應(yīng)空轉(zhuǎn)組細(xì)胞的增殖抑制率分別為3.52%、4.61%、4.84%； 4、Brdu-DAPI法示轉(zhuǎn)染組Brdu陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯少于空轉(zhuǎn)組及對(duì)照組,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論 RNF11能增強(qiáng)TGF-β1在Chang Liver細(xì)胞增殖過(guò)程中的增殖抑制作用,提示其對(duì)TGF-β傳導(dǎo)通路具有正性調(diào)節(jié)作用；RNF11可能成為肝臟增生調(diào)控的新靶點(diǎn),對(duì)研究肝臟增殖終止階段TGF-β1及TGF-β通路的作用具有一定意義。 意義 RNF11被認(rèn)為是細(xì)胞信號(hào)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的交叉點(diǎn),我們通過(guò)體外細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其對(duì)TGF-β信號(hào)的正性調(diào)節(jié)作用。另一方面,遺傳性出血性毛細(xì)血管擴(kuò)張癥的致病原因?yàn)門GF-β通路相關(guān)基因突變,導(dǎo)致TGF-β傳導(dǎo)通路受阻。針對(duì)“單倍劑量不足”的致病機(jī)制,增強(qiáng)TGF-β信號(hào)的方法或許能起到治療作用,而RNF11與TGF-β傳導(dǎo)通路相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究正是有益的嘗試,為下一步應(yīng)用TGF-β通路相關(guān)調(diào)節(jié)因子調(diào)控血管生成及治療HHHT的實(shí)驗(yàn)研究做前期準(zhǔn)備。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R575

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2659459