【摘要】：目的：肝纖維化是各種慢性肝病發(fā)展到肝硬化和肝癌必經(jīng)的病理過程。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell, HSC)是引起肝纖維化發(fā)生發(fā)展過程的關(guān)鍵細(xì)胞,激活的HSC可發(fā)生上皮-間質(zhì)的轉(zhuǎn)分化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)。EMT是肝纖維化和肝硬化的早期階段,這一階段是可以逆轉(zhuǎn)的。針對如何引導(dǎo)激活的HSC發(fā)生間質(zhì)-上皮(1mesenchymal to epithelial transition, MET)逆轉(zhuǎn)分化的研究,將對肝纖維化的治療具有重要的臨床意義。目前對HSC發(fā)生EMT的調(diào)控機(jī)制的研究尚不十分明確,近年來MicroRNAs對EMT的調(diào)控作用越來越引起國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。本實驗應(yīng)用乙醛激活HSC-T6,脂質(zhì)體lipofectamine2000瞬時轉(zhuǎn)染MicroRNA-200c(miR-200c)mimics,采用ELISA試劑盒檢測各組細(xì)胞分泌物Ⅰ型膠原蛋白(TIMP I)和纖維粘連蛋白(FN)含量的變化,采用Western-blot檢測細(xì)胞內(nèi)上皮鈣粘蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、Smad3、ZEB1(?)ZEB2蛋白表達(dá)量的變化,同時采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)技術(shù)檢測Smad3、 ZEB1(?)ZEB2在mRNA水平表達(dá)量的變化。研究ZEB1/2與EMT的相關(guān)性,進(jìn)一步探討miR-200c可能以ZEB1/2為作用靶點發(fā)揮對HSC-T6發(fā)生MET的調(diào)控作用。方法：本實驗分為兩個部分。(1)第一部分,實驗隨機(jī)分為乙醛刺激組(T組)和對照組(C組),應(yīng)用含有10%胎牛血清HDMEM培養(yǎng)基體外培養(yǎng)HSC-T6,同步化處理細(xì)胞12h,乙醛刺激組給予乙醛(終濃度200μmol/L)刺激,刺激時間為24h,對照組用等量培養(yǎng)基補(bǔ)齊。①分別提取T組和C組的細(xì)胞上清液用ELISA試劑盒檢測細(xì)胞分泌物TIMPⅠ和FN的含量變化。②應(yīng)用Western-blot技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)E-cadherin(?)vimentin表達(dá)量的變化。(2)第二部分,使用10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基體外培養(yǎng)HSC-T6。實驗隨機(jī)分組為：miR-200c模擬物陽性實驗組(miR-200c mimics)、miR-200c陰性對照組(miR-200c NC)和空白對照組(Blank)。各組分別給予乙醛(終濃度200μmol/L)刺激24h,并12h追加一次。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑lipofectamin2000進(jìn)行瞬時轉(zhuǎn)染。①收集各組細(xì)胞上清液檢測細(xì)胞分泌物TIMPⅠ和FN含量變化,②檢鋇E-cadherin、vimentin、Smad3、ZEB1(?)ZEB2蛋白表達(dá)量的改變,應(yīng)用Quantity One分析軟件對Western-blot印跡膜上的蛋白條帶灰度進(jìn)行半定量分析,所得實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)形式表示。實驗結(jié)果采用SPSS17.0對各組之間進(jìn)行隨機(jī)分組的方差分析,P0.05,認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。③應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測Smad3、ZEB1和ZEB2在mRNA水平的表達(dá)量的變化。結(jié)果：(1)第一部分結(jié)果：①ELISA試劑盒檢測結(jié)果顯示,與C組比較,T組細(xì)胞分泌物TIMP I和FN含量明顯增加,且P0.05。②應(yīng)用Western-blot技術(shù)檢測T組和C組E-cadherin(?)勺相對表達(dá)量分別為0.375+0.0223,0.824+0.0302；T組E-cadherin的相對表達(dá)量低于C組,P0.05。T組和C組vimentin的相對表達(dá)量分別為0.742+0.0384,0.487+0.0365；T組vimentin的相對表達(dá)量高于C組,P0.05。(2)第二部分結(jié)果：①與Blank組和1miR-200c NC組比較,miR-200c mimics組TIMP I和FN含量明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。②miR-200c mimics組E-cadherin相對表達(dá)量較其他兩組高,而vimentin、Smad3、ZEB1和ZEB2相對表達(dá)量較其他兩組低。③較Blank組和1miR-200c NC組,miR-200c mimics組ZEB1相對表達(dá)量相對較低,而Smad3mRNA不ZEB2在mRNA水平的相對表達(dá)量在各組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義,P0.05。結(jié)論：①第一部分實驗中,HSC-T6給予乙醛(終濃度200μmol/L)刺激24h后,HSC-T6被激活并發(fā)生由上皮細(xì)胞狀態(tài)向問質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)分化(EMT)。②第二部分實驗結(jié)果提示激活的HSC-T6經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-200c mimics后細(xì)胞由問質(zhì)狀態(tài)向上皮狀態(tài)發(fā)生逆轉(zhuǎn)分化(EMT),同時說明了miR-200c、ZEB1和ZEB2蛋白參與了細(xì)胞MET的調(diào)控,miR-200c可能的作用靶點是ZEB1(?)ZEB2。實驗結(jié)果進(jìn)一步表明miR-200c通過抑制ZEB1(?)ZEB2表達(dá)量而參與對EMT的調(diào)控,而這種抑制作用主要表現(xiàn)在蛋白水平上。
【圖文】：

采用終濃度 200μmol/L 為乙醛刺激細(xì)胞，12h 追加一次，觀察各組細(xì)胞蛋白的表達(dá)量用 Quantity one 分析目的蛋白條帶的灰度值，vimentin 蛋白灰度值與相應(yīng)內(nèi)參 βactin 蛋白條到 E-cadherin 和 vimentin 蛋白的相對表達(dá)量E-cadherin 蛋白的相對表達(dá)量為 0.375±0.0 223的相對表達(dá)量為 0.824±0.0 302，且 P<0.05，差2a,b）。1.2 Western blot 技術(shù)檢測 E-cadherin 和 vime

圖 5 轉(zhuǎn)染后，激活的 HTC-T6 細(xì)胞內(nèi) E-cadherin、vimentin、 Smad3、ZEB2 的蛋白相對表達(dá)量Fig.5 Afer transfecton,the relative expreeion of E-cadherin,vimentin,Smad3,ZEBin actived HSC-T6 cells2.3 轉(zhuǎn)染后 RT-PCR 技術(shù)檢 測 Smad3、ZEB1 和 ZEB2 在 m平的表達(dá)量2.3.1 總 RNA 質(zhì)量的鑒定用總 RNA 提取試劑盒（離心柱型）提取細(xì)胞內(nèi)總 RNA，通分光光度儀（NanoDrop ND-1000）測量所提取總 RNA 的濃度測得的 A260/280 值為在 1.8-2.0 之間，，濃度均大于 200 ng/μ脂糖凝膠電泳跑膠結(jié)果（如圖 10）顯示，28S 和 18S 條帶清
【學(xué)位授予單位】：瀘州醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R575.2

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4 周雪;徐e

本文編號：2656763