【摘要】：酒精性肝�。╝lcoholic liver disease，ALD）為影響人們健康的主要肝臟疾病之一。ALD包括酒精性脂肪肝、酒精性肝炎、酒精性肝纖維化和肝硬化一系列病理改變。90%長期過量飲酒者可發(fā)生脂肪肝，30-37%可進(jìn)展為酒精性肝纖維化及肝硬化，并有5-15%患者即使戒酒仍可發(fā)生酒精性肝纖維化及肝硬化，此可能與酒精導(dǎo)致的過度脂肪堆積引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致肝細(xì)胞凋亡及炎癥、纖維化有關(guān)。至今酒精性肝炎、肝纖維化發(fā)病的分子生物機(jī)制尚未完全闡明，因此，建立與人類比擬性好的進(jìn)展性ALD動物模型并探明其發(fā)病機(jī)制、進(jìn)一步明確關(guān)鍵基因調(diào)控對該病的治療作用將為ALD的防治開拓新思路。 過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator activatedreceptor alpha，PPARα）是調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子，可通過調(diào)控肝內(nèi)脂肪酸合成、氧化及轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)，糾正肝臟脂質(zhì)代謝紊亂，減少肝組織脂質(zhì)沉積，并減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，抑制炎癥因子及促纖維化因子產(chǎn)生和釋放，阻止/減輕肝組織損傷，靶向調(diào)控PPARα有望成為治療ALD的有效措施。 本研究采用Lieber-DeCarli酒精液體飼料喂養(yǎng)C57BL/6J小鼠建立酒精性肝炎模型，應(yīng)用酒精液體飼料喂養(yǎng)聯(lián)合微量四氯化碳腹腔注射建立酒精性肝纖維化模型。旨在揭示酒精性肝損傷發(fā)生機(jī)制，并闡明PPARα在酒精性肝炎/肝纖維化進(jìn)展中的作用及分子機(jī)制，為臨床有效防治ALD提供新的作用靶點(diǎn)和理論依據(jù)。 第一部分酒精性肝炎/肝纖維化動物模型的建立及肝組織PPARα表達(dá)與作用的研究 目的：建立酒精性肝炎、肝纖維化動物模型，探討肝組織PPARα在酒精性肝炎、肝纖維化發(fā)病中的表達(dá)變化及其作用。 方法：選用健康雄性C57BL/6J小鼠，采用含4%酒精的Lieber-DeCarli液體飼料喂養(yǎng)12周建立酒精性肝炎模型，以不含酒精對照液體飼料喂養(yǎng)小鼠作為對照組；采用Lieber-DeCarli液體飼料喂養(yǎng)小鼠4周后聯(lián)合微量四氯化碳腹腔注射至8周建立進(jìn)展性酒精性肝纖維化模型，于造模第0、4、5、6、7、8周各處死6只小鼠，設(shè)立對照組、四氯化碳組、酒精組及溶劑對照組，于造模第8周處死各組小鼠。酶法檢測血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanineaminotransferase， ALT）及天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartateaminotransferase，AST）水平；蘇木素-伊紅（Haematoxylin and eosin，HE）染色及Masson染色觀察肝組織脂肪變性、炎癥及纖維化程度；透射電鏡分析觀察肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變；免疫組織化學(xué)染色觀察肝組織α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）表達(dá)變化；實(shí)時熒光定量PCR及Western blot檢測肝組織PPARα mRNA及蛋白表達(dá)變化。 結(jié)果：含4%酒精Lieber-DeCarli液體飼料喂養(yǎng)小鼠12周可成功建立酒精性肝炎模型；Lieber-DeCarli液體飼料喂養(yǎng)4周后聯(lián)合微量四氯化碳腹腔注射至8周可快速建立酒精性肝纖維化模型。 1酒精性肝炎模型血清生化學(xué)、肝組織病理學(xué)特點(diǎn)及PPARα表達(dá)變化 1.1實(shí)驗(yàn)小鼠血清ALT及AST水平： 酒精組小鼠血清ALT（150.33±20.68vs58.83±15.79U/L，P 0.001）及AST（259.67±28.13vs105.17±13.83U/L，P 0.001）水平較對照組小鼠顯著升高。 1.2實(shí)驗(yàn)小鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn)： 對照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常；酒精組小鼠肝組織可見肝細(xì)胞氣球樣變、脂肪變性，小葉內(nèi)可見少量點(diǎn)狀肝細(xì)胞壞死，伴有少量單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤。 1.3實(shí)驗(yàn)小鼠肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化： 對照組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器含量豐富，可見大量線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等。酒精組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)可見大小不等的脂滴，核周附近細(xì)胞內(nèi)線粒體大部分嵴和部分膜融合，模糊不清，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有明顯顆粒融合或脫顆�，F(xiàn)象，游離核糖體數(shù)量減少。 1.4實(shí)驗(yàn)小鼠肝組織PPARα表達(dá)變化： 酒精組小鼠肝組織PPARα mRNA（0.72±0.03vs0.97±0.07，P 0.05）及蛋白（0.48±0.12vs0.83±0.13，P 0.05）表達(dá)均較對照組小鼠減少。 2酒精性肝纖維化模型血清生化學(xué)、肝組織病理學(xué)特點(diǎn)及PPARα表達(dá)變化 2.1實(shí)驗(yàn)小鼠血清ALT及AST水平： 四氯化碳組（107.00±20.77U/L，P 0.01）及酒精組（76.00±5.76U/L，P 0.05）小鼠ALT水平較對照組（63.50±7.82U/L）升高，酒精組AST水平較對照組升高（300.50±34.16vs103.17±16.15U/L，P 0.01）。酒精+四氯化碳組小鼠血清ALT（1072.50±109.19U/L）及AST（838.17±153.73U/L）水平顯著高于其它各組（P 0.01）。酒精+四氯化碳組小鼠血清ALT及AST水平隨時間呈逐漸升高趨勢，0、4、5、6、7、8周ALT水平依次為73.00±10.33、66.83±6.27、159.90±19.75、199.00±17.60、176.17±15.63及1072.50±109.19U/L，AST水平依次為98.17±12.62、252.50±23.84、480.00±17.40、544.50±72.88、491.67±13.94及838.17±153.73U/L。 2.2實(shí)驗(yàn)小鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn)： 造模8周，對照組小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常。四氯化碳組小鼠肝組織病變輕微，可見少量炎性細(xì)胞浸潤，竇周及匯管區(qū)可見少量纖維組織沉積。酒精組及溶劑對照組小鼠肝組織病變以肝細(xì)胞脂肪變性為主，可見少量炎細(xì)胞浸潤。酒精+四氯化碳組小鼠造模第4周時主要表現(xiàn)為輕-中度肝脂肪變性，第5周出現(xiàn)炎細(xì)胞浸潤，竇周出現(xiàn)纖維組織沉積，第6-7周肝小葉內(nèi)可見點(diǎn)、灶狀肝細(xì)胞壞死，炎細(xì)胞浸潤、竇周纖維組織沉積呈進(jìn)行性加重，第8周可見肝細(xì)胞片狀壞死，大量炎細(xì)胞浸潤，橋接纖維化形成。 2.3實(shí)驗(yàn)小鼠肝組織α-SMA表達(dá)： 對照組、四氯化碳組、酒精組及溶劑對照組小鼠肝組織表達(dá)少量α-SMA。酒精+四氯化碳組小鼠肝組織α-SMA表達(dá)自第5周起進(jìn)行性增加，主要表達(dá)于竇周活化肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）及纖維組織沉積區(qū)域。 2.4實(shí)驗(yàn)小鼠肝組織PPARα表達(dá) 四氯化碳組小鼠肝組織PPARα mRNA水平（P 0.01）、酒精組小鼠肝組織PPARα mRNA及蛋白水平（P 0.05及P 0.01）較對照組小鼠降低。酒精+四氯化碳組小鼠PPARα mRNA及蛋白水平較四氯化碳組（P 0.01，P 0.01）及酒精組（P 0.01，P 0.05）小鼠進(jìn)一步降低。 結(jié)論： 1含4%酒精Lieber-DeCarli液體飼料喂養(yǎng)12周可成功建立小鼠酒精性肝炎模型，Lieber-DeCarli酒精液體飼料喂養(yǎng)4周聯(lián)合微量四氯化碳腹腔注射至8周可快速建立小鼠酒精性肝纖維化模型，血清生化學(xué)、肝組織病理學(xué)改變符合酒精性肝炎、肝纖維化病變特點(diǎn)，模型穩(wěn)定性好，成功率高；2隨著酒精性肝炎、肝纖維化發(fā)病與進(jìn)展，肝組織PPARα表達(dá)減少，并與肝損傷程度有關(guān)。 第二部分PPARα調(diào)控對小鼠酒精性肝炎的治療作用及其機(jī)制研究 目的：探明PPARα活性調(diào)節(jié)對小鼠酒精性肝炎的治療作用及其關(guān)鍵信號通路。 方法：Lieber-DeCarli酒精液體飼料喂養(yǎng)C57BL/6J小鼠12周建立酒精性肝炎模型，造模最后2周應(yīng)用PPARα激動劑WY14643及抑制劑GW6471進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)。酶法檢測小鼠血清ALT和AST水平；HE染色觀察肝組織脂肪變性及炎癥程度；透射電鏡分析觀察肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變；實(shí)時熒光定量PCR和Western blot法檢測PPARα、PPARα靶基因細(xì)胞色素P4504A10（cytochrome P4504A10，CYP4A10）、CYP4A14、脂質(zhì)代謝相關(guān)基因成纖維生長因子21（fibroblast growth factor21，F(xiàn)GF21）、沉默交配型信息調(diào)節(jié)因子2同源蛋白1（Sirtuin1，SIRT1）、PPARγ輔激活子1α（PPARγcoactivator-1α，PGC-1α）、脂肪酸合酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）、促炎因子磷脂酰肌醇(-3)激酶（phosphatidylinositol3-kinase，PI3K）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）、環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）、抗炎因子脂聯(lián)素及血紅素氧合酶-1（heme oxygeanse-1，HO-1）表達(dá)變化。 結(jié)果：PPARα激動劑可明顯減輕酒精導(dǎo)致的肝脂肪變性及炎癥反應(yīng)。 1實(shí)驗(yàn)小鼠血清ALT及AST水平： 對照組及酒精組小鼠血清ALT及AST水平同第1部分。激動劑組小鼠ALT（84.00±25.81U/L）及AST（180.33±16.48U/L）水平較酒精組顯著降低（P 0.001）。抑制劑組小鼠ALT水平（186.00±20.86U/L）較酒精組進(jìn)一步升高（P 0.05），AST水平（282.17±25.09U/L）與酒精組無差異。 2實(shí)驗(yàn)小鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn)： PPARα激動劑可明顯減輕酒精喂養(yǎng)小鼠肝組織損傷，肝細(xì)胞輕度氣球樣變，輕度脂肪變性，未見明顯肝細(xì)胞壞死及炎性細(xì)胞浸潤。 3實(shí)驗(yàn)小鼠肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化： PPARα激動劑可明顯改善酒精喂養(yǎng)小鼠肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷，肝細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯減少，線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及游離核糖體未見明顯損傷。 4實(shí)驗(yàn)小鼠肝組織PPARα及靶基因表達(dá)： 對照組及酒精組小鼠肝組織PPARα mRNA及蛋白表達(dá)水平同第1部分。酒精組CYP4A10及CYP4A14mRNA表達(dá)均較對照組小鼠減少。激動劑組小鼠PPARα mRNA及蛋白表達(dá)、CYP4A10及CYP4A14mRNA表達(dá)較酒精組增加（P 0.05）。抑制劑組小鼠PPARα及CYP4A14mRNA表達(dá)較酒精組進(jìn)一步減少（P 0.05）。 5實(shí)驗(yàn)小鼠肝組織脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)： 酒精組小鼠肝組織SIRT1mRNA及蛋白、PGC-1α蛋白表達(dá)較對照組減少（P 0.01），F(xiàn)AS mRNA及蛋白表達(dá)較對照組小鼠增加（P 0.001）。激動劑組小鼠肝組織FGF21、SIRT1及PGC-1α mRNA及蛋白表達(dá)較酒精組增多（P 0.05），F(xiàn)AS mRNA及蛋白表達(dá)較酒精組減少（P 0.05）。抑制劑組FGF21mRNA及蛋白表達(dá)較酒精組減少（P 0.05），F(xiàn)AS mRNA表達(dá)較酒精組進(jìn)一步增多（P 0.01）。 6實(shí)驗(yàn)小鼠肝組織炎癥因子表達(dá)： 酒精組小鼠肝組織促炎因子PI3K mRNA、OPN及COX-2mRNA及蛋白表達(dá)較對照組增多（P 0.01），抗炎因子脂聯(lián)素mRNA及蛋白表達(dá)減少（P 0.001）。激動劑組小鼠肝組織PI3K、OPN及COX-2mRNA及蛋白表達(dá)較酒精組顯著下調(diào)（P 0.05），脂聯(lián)素及HO-1表達(dá)顯著上調(diào)（P0.01）。抑制劑組小鼠PI3K蛋白及COX-2mRNA表達(dá)較酒精組進(jìn)一步增多（P 0.05）。 結(jié)論： 1PPARα激動劑可顯著減輕酒精喂養(yǎng)小鼠肝脂肪變及炎癥反應(yīng)，改善肝細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)損傷，PPARα抑制劑則加重肝損傷； 2PPARα激活可通過上調(diào)肝組織促脂肪酸氧化基因表達(dá)、下調(diào)促脂質(zhì)合成基因表達(dá)，阻止酒精導(dǎo)致的脂質(zhì)代謝紊亂，減輕肝細(xì)胞脂肪累積； 3PPARα激活可抑制肝組織促炎因子表達(dá)，促進(jìn)抗炎因子表達(dá)，減輕肝臟炎癥反應(yīng)。 第三部分PPARα調(diào)控對小鼠酒精性肝纖維化的治療作用及其機(jī)制研究 目的：明確PPARα基因調(diào)控對酒精性肝纖維化的治療作用；通過對肝組織炎癥及纖維化相關(guān)基因表達(dá)變化的研究，進(jìn)一步闡明酒精性肝纖維化發(fā)病分子機(jī)制以及PPARα治療酒精性肝纖維化的主要分子機(jī)制。 方法：選用C57BL/6J小鼠，以酒精液體飼料喂養(yǎng)聯(lián)合微量四氯化碳腹腔注射建立酒精性肝纖維化模型，造模最后2周應(yīng)用PPARα激動劑WY14643及抑制劑GW6471進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)。采用酶法檢測小鼠血清ALT和AST水平；HE及Masson染色觀察肝脂肪變性、炎癥及纖維化程度；免疫組織化學(xué)染色觀察肝組織α-SMA表達(dá)變化；實(shí)時熒光定量PCR和Westernblot方法檢測PPARα、炎癥因子腫瘤壞死因子alpha （tumor necrosisfactor-alpha，TNF-α）、白細(xì)胞介素-10（Interleukin-10，IL-10）、促纖維化因子OPN、轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、內(nèi)臟脂肪素、PI3K、基質(zhì)金屬蛋白酶-（2matrix metallopeptidase-2，MMP-2）、MMP-9及抗纖維化因子脂聯(lián)素及HO-1表達(dá)變化。 結(jié)果：PPARα激動劑可明顯減輕酒精及四氯化碳聯(lián)合作用導(dǎo)致的肝臟炎癥及纖維化程度。 1實(shí)驗(yàn)小鼠血清ALT及AST水平： 對照組、四氯化碳組、酒精組及酒精+四氯化碳組小鼠血清ALT及AST水平同第1部分。激動劑組小鼠ALT（131.17±48.11U/L）及AST（202.83±31.73U/L）水平較酒精+四氯化碳組顯著降低（P 0.01）。抑制劑組AST水平（1000.33±85.54U/L）較酒精+四氯化碳組進(jìn)一步升高（P0.05）。 2實(shí)驗(yàn)小鼠肝組織病理學(xué)表現(xiàn)： PPARα激動劑可顯著減輕酒精與四氯化碳聯(lián)合處理小鼠肝組織炎癥及纖維化程度，肝小葉內(nèi)少量炎細(xì)胞浸潤，竇周及匯管區(qū)少量纖維組織沉積。 3實(shí)驗(yàn)小鼠肝組織α-SMA表達(dá)： 激動劑組小鼠肝組織α-SMA表達(dá)較酒精+四氯化碳組顯著減少，僅在中央靜脈、匯管區(qū)血管及少量纖維組織沉積區(qū)域可見。 4實(shí)驗(yàn)小鼠肝組織PPARα表達(dá)： 對照組、四氯化碳組、酒精組及酒精+四氯化碳組小鼠肝組織PPARαmRNA及蛋白表達(dá)水平同第1部分。激動劑組PPARα mRNA及蛋白表達(dá)較酒精+四氯化碳組小鼠顯著增多（P 0.01），而抑制劑組PPARα mRNA表達(dá)較酒精+四氯化碳組進(jìn)一步減少（P 0.01）。 5實(shí)驗(yàn)小鼠肝組織炎癥因子表達(dá)： 四氯化碳組及酒精組小鼠肝組織促炎因子TNF-α mRNA表達(dá)水平（P0.01）較對照組升高，抗炎因子IL-10mRNA表達(dá)水平降低（P 0.01）。酒精+四氯化碳組TNF-α水平可較四氯化碳組及酒精組進(jìn)一步升高（P 0.01）、IL-10mRNA表達(dá)水平進(jìn)一步降低（P 0.01）。激動劑組TNF-αmRNA表達(dá)較酒精+四氯化碳組減少（P 0.01），IL-10mRNA表達(dá)較酒精+四氯化碳組增多（P 0.01）。 6實(shí)驗(yàn)小鼠肝組織促纖維化因子表達(dá)： 與對照組比較，四氯化碳組小鼠肝組織OPN、內(nèi)臟脂肪素、MMP-2mRNA及蛋白表達(dá)均增強(qiáng)（P 0.05），TGF-β1及PI3KmRNA表達(dá)上調(diào)（P0.01），MMP-9蛋白表達(dá)增加（P 0.01）。酒精組小鼠肝組織OPN、TGF-β1、內(nèi)臟脂肪素、PI3K mRNA及蛋白表達(dá)均較對照組增多（P 0.05），MMP-2mRNA及MMP-9蛋白表達(dá)增多（P 0.05）。酒精+四氯化碳組OPN、TGF-β1、內(nèi)臟脂肪素、PI3K、MMP-2及MMP-9mRNA及蛋白表達(dá)較四氯化碳組進(jìn)一步增多（P 0.05），而TGF-β1、內(nèi)臟脂肪素、PI3K、MMP-2、MMP-9mRNA及蛋白表達(dá)較酒精組增多（P 0.05），，OPN mRNA表達(dá)較酒精組增多（P 0.01）。激動劑組OPN、TGF-β1、內(nèi)臟脂肪素、PI3K、MMP-2及MMP-9mRNA及蛋白表達(dá)較酒精+四氯化碳組顯著減少（P 0.01）。 7實(shí)驗(yàn)小鼠肝組織抗纖維化因子表達(dá)： 與對照組小鼠比較，四氯化碳組小鼠肝組織脂聯(lián)素mRNA及蛋白表達(dá)水平降低（P 0.01），HO-1表達(dá)水平升高（P 0.05）。酒精組小鼠肝組織脂聯(lián)素（P 0.01及P 0.001）表達(dá)水平較對照組降低，HO-1（P 0.01及P 0.05）表達(dá)水平升高。酒精+四氯化碳組脂聯(lián)素mRNA及蛋白表達(dá)較四氯化碳組及酒精組進(jìn)一步減少（P 0.05），HO-1表達(dá)較四氯化碳組增多（P 0.05），蛋白表達(dá)較酒精組增多（P 0.05）。激動劑組脂聯(lián)素及HO-1mRNA及蛋白表達(dá)較酒精+四氯化碳組顯著增多（P 0.01），而抑制劑組脂聯(lián)素及HO-1mRNA表達(dá)較酒精+四氯化碳組減少（P 0.05）。 結(jié)論： 1在酒精及微量四氯化碳聯(lián)合作用下，肝組織促炎、促纖維化因子表達(dá)上調(diào)，抗炎、抗纖維化因子表達(dá)下調(diào)，激活HSC，導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生并進(jìn)展；2PPARα激動劑下調(diào)促炎、促纖維化因子表達(dá)，上調(diào)抗炎、抗纖維化因子表達(dá)，減輕肝組織損傷，阻止HSC活化，顯著減輕酒精性肝纖維化。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R575

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

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本文編號：2656736