【摘要】：研究背景與目的 肝纖維化和它的終末階段肝硬化在世界范圍威脅著人類健康。乙型、丙型病毒性肝炎、酒精性肝病及非酒精性肝病所引起的肝纖維化、肝硬化也相當(dāng)常見。研究表明肝硬化是不可逆的,而肝纖維化是可逆的。因此,有效的抗纖維化治療就成了一個非常緊迫的問題。肝星狀細胞(hepatic stellate cell,HSC)的激活是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié),也是目前研究的熱點。但是近3年的研究又認為肝細胞在肝纖維化中亦起到非常重要的作用。 肝細胞約占肝臟細胞總量的80%,數(shù)量最多,功能重要。肝細胞的炎癥壞死,肝細胞損傷,脂質(zhì)過氧化,凋亡等均在促使肝纖維化中起到重要作用。越來越多研究表明,除HSC在肝纖維化發(fā)生學(xué)中是主要的纖維源性細胞外,肝細胞也具有潛在的纖維源性[2]。并且研究認為肝細胞主要是通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化為成纖維細胞從而促使肝纖維化的形成。 TLR作為主要的模式識別受體,在機體先天性免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用,并在肝臟疾病包括酒精性肝病、病毒性肝炎、肝纖維化等的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用為此,本論文研究目的旨在揭示肝細胞EMT現(xiàn)象中是否有TLR的調(diào)節(jié)作用,以深入闡明肝纖維化的發(fā)病機制,也為肝纖維化的早期干預(yù)提供新的思路。 方法 一、肝細胞的分離與鑒定 雄性Sprague-Darwley大鼠(150g-200g),分離門靜脈并插管,依次灌注膠原酶,37℃原位消化,3次4℃水平離心得到肝細胞,于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12中培養(yǎng),隔天更換培養(yǎng)液。臺盼藍染色鑒定細胞存活率。顯微鏡下觀察死亡與正常的肝細胞,鑒定肝細胞成活率。 二、TGF-β刺激肝細胞產(chǎn)生EMT現(xiàn)象 當(dāng)細胞生長基本貼滿皿底時,以含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液中加入TGF-β(5 ng/mL)作用48 h后,使用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)學(xué)的改變并拍照。以不加TGF-β組作為對照組。提取細胞總RNA,PCR檢測E-cad、vimentin的mRNA表達。 三、TLR2在肝細胞EMT現(xiàn)象中的表達 普通PCR檢測E-cad、vimentin的mRNA表達后,再檢測TLR2 mRNA的表達。 四、統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,數(shù)據(jù)由SPSS 13.0軟件統(tǒng)計包處理。兩組之間比較用t檢驗,相關(guān)性比較用線性相關(guān),多組間的比較用One-Way ANOVA方差分析:方差齊性用LSD方法比較;方差不齊用Dunnett’s方法比較。P0.05認為有統(tǒng)計學(xué)差異。 結(jié)果 一、肝細胞鑒定臺盼藍染色鑒定肝細胞存活率95%以上,能滿足實驗要求。 二、TGF-β刺激肝細胞產(chǎn)生EMT現(xiàn)象 (一)TGF-β刺激肝細胞對細胞形態(tài)的影響TGF-β刺激48小時的肝細胞細胞形態(tài)由平鋪彌漫的島狀細胞變成紡錘形間隙較大的細胞。細胞逐漸分離。 (二)TGF-beta對肝細胞EMT現(xiàn)象相關(guān)指標(biāo)mRNA的影響TGF-β刺激48小時的肝細胞的E-cad mRNA表達明顯低于不加刺激的正常HC的表達(P0.05)。而TGF-β刺激48小時的肝細胞的vimentin mRNA表達明顯高于不加刺激的正常肝細胞的表達(P0.05)。 三、TLR2在肝細胞EMT現(xiàn)象中的表達TGF-β刺激48小時的肝細胞的TLR2 mRNA與蛋白水平的表達明顯高于不加刺激的正常HC的表達(P0.05)。 結(jié)論 一、TGF-β刺激肝細胞可引起肝細胞形態(tài)學(xué)的變化,E-cad mRNA水平表達下降,vimentin mRNA水平表達上升。提示TGF-β可以促使肝細胞產(chǎn)生EMT現(xiàn)象。 二、TGF-β刺激肝細胞產(chǎn)生EMT現(xiàn)象時TLR2從中起到一定的作用。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R575.2

【參考文獻】

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1 萬幸,王培訓(xùn),周聯(lián),向群;脂多糖刺激前后小鼠肺肝脾組織中Toll樣等受體基因表達情況[J];中國危重病急救醫(yī)學(xué);2004年02期

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本文編號：2653521