【摘要】： HCV感染呈全球性分布，以不發(fā)達國家感染率為高，我國約為3％，該病原�？梢鸪掷m(xù)感染，且與肝硬化及肝癌發(fā)生率明顯相關(guān)，是當(dāng)前嚴重危害人類健康的重要傳染病。由于其體外培養(yǎng)尚未成功，至今尚無滿意的感染模型，因而極大的限制了HCV的研究及丙型肝炎的防治工作。迄今為止尚無有效的治療策略。所以，尋找新的抗病毒策略，預(yù)防和清除HCV持續(xù)感染很有必要�；蛑委熥鳛橐环N新型的治療策略對HCV感染防治具有重要的意義，近年來得到國內(nèi)外學(xué)者廣泛認同的策略主要包括反義核酸策略、核酶策略、細胞內(nèi)干擾性多肽或蛋白策略、抑制性RNA策略等。 HCV為一單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒屬嗜肝病毒科。HCV基因含一長的5′UTR，內(nèi)含多個起始密碼子(AUGs)，具特異的二級結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)同脊髓灰質(zhì)炎病毒(PV)和腦心肌炎病毒(EMCV)的核糖體內(nèi)部進入位點(IRES)相似。IRES作為HCV基因表達和復(fù)制的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)成為基因治療的靶位點之一。IRNA為Coward和Dasgupta在研究PV時，偶然發(fā)現(xiàn)的一段60nt的核酸片段，對PV病毒的復(fù)制和表達具有較強的抑制作用。為此，探討IRNA在體內(nèi)外對HCV基因表達的抑制作用，對HCV感染的防治具有重要的現(xiàn)實意義。 本研究應(yīng)用分子克隆技術(shù)，構(gòu)建了將具自剪切作用的順式核酶序列引入IRNA序列兩端可保持IRNA一級和二級結(jié)構(gòu)完整性的原核及真核表達體，并以此為基礎(chǔ)對IRNA在體外無細胞翻譯體系中對HCV IRES介導(dǎo)非帽結(jié)構(gòu)依賴 第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 性蛋白翻譯的抑制作用進行了研究。此外，應(yīng)用脂質(zhì)體細胞轉(zhuǎn)染方法及新霉 素抗性篩選建立了表達IRNA及mIRNA的HHCC細胞，并應(yīng)用相同方法建立了 含HCV IRES的HCV復(fù)制子。在此基礎(chǔ)上探討了 IRNA在細胞內(nèi)瞬時表達及長 期表達對HCV IRES介導(dǎo)蛋白表達的抑制作用。最后，我們應(yīng)用PV疫苗株感 染 IRNA表達細胞，并對其病毒致細胞病變效應(yīng)及病毒滴度進行了滴定。此 外，我們還初步探討了IRNA抑制HCV IRES介導(dǎo)蛋白翻譯作用機理。 結(jié)果如下： 1．構(gòu)建了ICh及W原核表達載體地讀m認證論同mM及到較前撤然 PcRz－IRNA／PcRz－mIRNA，于目標序歹兩端引入具自剪切作用的順式 核酶序列。 2．將pGRz－IRNA及pGRz－mIRNA體夕轉(zhuǎn)錄體與含HCV IRES完整結(jié)構(gòu)的 雙順反子對70C卜34和單順反子…W訛RIUc體外轉(zhuǎn)錄體在免網(wǎng)狀 紅細胞無細胞翻譯體系中進行體外蛋白翻譯，證實IRNA／。IRNA在體 外對 HCV RES介導(dǎo)蛋白翻譯具抑制作用。 3．PCRZIRNA與含 HCV IRES的 PCM’VNCRlll。共轉(zhuǎn)染 HHCC細胞后，表現(xiàn)出 明顯的抑制熒光素酶表達作用：pCRZIRNA轉(zhuǎn)染含HCV IRES的HCV 復(fù)制于也表現(xiàn)出一定的細胞內(nèi)抑制HCV IRES介導(dǎo)蛋白翻譯的作用。 HCV IRES介導(dǎo)蛋白翻譯作用在IRNA表達細胞中也受到明顯抑制。 4．脊髓灰質(zhì)炎病毒在IRNA表達細胞內(nèi)的增殖受到明顯抑制。 5．IRNA對 HCV 5’UTR與細胞性蛋白多肽的結(jié)合作用具有明顯的競爭抑 制作用。
【圖文】：

DLZOOODNAMarker，2peDNA3APal/凡觀廳I雙酶切，3peRz一IRNA助al/及翻班雙酶切，4peRz一mIRNA助al/丑:又刃班雙酶切，5人DNA/HJ’ndIII+Ec研I雙酶切。圖1一8真核質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果28

l234l，2peRz一IRNAPCR產(chǎn)物，3peRz朋IRNAPCR產(chǎn)物，，4DL2000DNAMarker。圖1一9真核質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果……_…_{{{}}}、井疊羹羹圖1一10真核質(zhì)粒測序圖29
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：R512.6

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本文編號：2653153