【摘要】： HCV感染呈全球性分布，以不發(fā)達(dá)國家感染率為高，我國約為3％，該病原�？梢鸪掷m(xù)感染，且與肝硬化及肝癌發(fā)生率明顯相關(guān)，是當(dāng)前嚴(yán)重危害人類健康的重要傳染病。由于其體外培養(yǎng)尚未成功，至今尚無滿意的感染模型，因而極大的限制了HCV的研究及丙型肝炎的防治工作。迄今為止尚無有效的治療策略。所以，尋找新的抗病毒策略，預(yù)防和清除HCV持續(xù)感染很有必要�；蛑委熥鳛橐环N新型的治療策略對HCV感染防治具有重要的意義，近年來得到國內(nèi)外學(xué)者廣泛認(rèn)同的策略主要包括反義核酸策略、核酶策略、細(xì)胞內(nèi)干擾性多肽或蛋白策略、抑制性RNA策略等。 HCV為一單股正鏈RNA病毒，屬于黃病毒屬嗜肝病毒科。HCV基因含一長的5′UTR，內(nèi)含多個起始密碼子(AUGs)，具特異的二級結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)同脊髓灰質(zhì)炎病毒(PV)和腦心肌炎病毒(EMCV)的核糖體內(nèi)部進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)相似。IRES作為HCV基因表達(dá)和復(fù)制的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)成為基因治療的靶位點(diǎn)之一。IRNA為Coward和Dasgupta在研究PV時，偶然發(fā)現(xiàn)的一段60nt的核酸片段，對PV病毒的復(fù)制和表達(dá)具有較強(qiáng)的抑制作用。為此，探討IRNA在體內(nèi)外對HCV基因表達(dá)的抑制作用，對HCV感染的防治具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。 本研究應(yīng)用分子克隆技術(shù)，構(gòu)建了將具自剪切作用的順式核酶序列引入IRNA序列兩端可保持IRNA一級和二級結(jié)構(gòu)完整性的原核及真核表達(dá)體，并以此為基礎(chǔ)對IRNA在體外無細(xì)胞翻譯體系中對HCV IRES介導(dǎo)非帽結(jié)構(gòu)依賴 第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 性蛋白翻譯的抑制作用進(jìn)行了研究。此外，應(yīng)用脂質(zhì)體細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法及新霉 素抗性篩選建立了表達(dá)IRNA及mIRNA的HHCC細(xì)胞，并應(yīng)用相同方法建立了 含HCV IRES的HCV復(fù)制子。在此基礎(chǔ)上探討了 IRNA在細(xì)胞內(nèi)瞬時表達(dá)及長 期表達(dá)對HCV IRES介導(dǎo)蛋白表達(dá)的抑制作用。最后，我們應(yīng)用PV疫苗株感 染 IRNA表達(dá)細(xì)胞，并對其病毒致細(xì)胞病變效應(yīng)及病毒滴度進(jìn)行了滴定。此 外，我們還初步探討了IRNA抑制HCV IRES介導(dǎo)蛋白翻譯作用機(jī)理。 結(jié)果如下： 1．構(gòu)建了ICh及W原核表達(dá)載體地讀m認(rèn)證論同mM及到較前撤然 PcRz－IRNA／PcRz－mIRNA，于目標(biāo)序歹兩端引入具自剪切作用的順式 核酶序列。 2．將pGRz－IRNA及pGRz－mIRNA體夕轉(zhuǎn)錄體與含HCV IRES完整結(jié)構(gòu)的 雙順反子對70C卜34和單順反子…W訛RIUc體外轉(zhuǎn)錄體在免網(wǎng)狀 紅細(xì)胞無細(xì)胞翻譯體系中進(jìn)行體外蛋白翻譯，證實(shí)IRNA／。IRNA在體 外對 HCV RES介導(dǎo)蛋白翻譯具抑制作用。 3．PCRZIRNA與含 HCV IRES的 PCM’VNCRlll。共轉(zhuǎn)染 HHCC細(xì)胞后，表現(xiàn)出 明顯的抑制熒光素酶表達(dá)作用：pCRZIRNA轉(zhuǎn)染含HCV IRES的HCV 復(fù)制于也表現(xiàn)出一定的細(xì)胞內(nèi)抑制HCV IRES介導(dǎo)蛋白翻譯的作用。 HCV IRES介導(dǎo)蛋白翻譯作用在IRNA表達(dá)細(xì)胞中也受到明顯抑制。 4．脊髓灰質(zhì)炎病毒在IRNA表達(dá)細(xì)胞內(nèi)的增殖受到明顯抑制。 5．IRNA對 HCV 5’UTR與細(xì)胞性蛋白多肽的結(jié)合作用具有明顯的競爭抑 制作用。
【圖文】：

DLZOOODNAMarker，2peDNA3APal/凡觀廳I雙酶切，3peRz一IRNA助al/及翻班雙酶切，4peRz一mIRNA助al/丑:又刃班雙酶切，5人DNA/HJ’ndIII+Ec研I雙酶切。圖1一8真核質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果28

l234l，2peRz一IRNAPCR產(chǎn)物，3peRz朋IRNAPCR產(chǎn)物，，4DL2000DNAMarker。圖1一9真核質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果……_…_{{{}}}、井疊羹羹圖1一10真核質(zhì)粒測序圖29
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：R512.6

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本文編號：2653153