【摘要】：終末期肝病(End-stage liver disease，ELD)是各種急性或慢性肝臟疾病逐步發(fā)展的最后共同階段。肝星狀細(xì)胞在各種肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程中起重要的作用，它是肝臟細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular Matrix，ECM)的主要合成細(xì)胞，亦是肝纖維化發(fā)生的核心細(xì)胞，它的激活及轉(zhuǎn)化是肝纖維化發(fā)生的前提。目前，關(guān)于終末期肝病的治療手段非常有限，最佳選擇是肝臟移植。但是該方法受限于臨床供體短缺，手術(shù)費用高昂以及移植術(shù)后嚴(yán)重的排斥反應(yīng)，因此我們迫切需要一種新的治療方法治療終末期肝病并改善患者的生存質(zhì)量。 干細(xì)胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞群體。我們根據(jù)干細(xì)胞的來源將其分為胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞。肝臟干細(xì)胞屬于成體干細(xì)胞中一類，進(jìn)一步分為肝源性干細(xì)胞主要為卵圓細(xì)胞，，非肝源性干細(xì)胞包括骨髓造血干細(xì)胞以及間充質(zhì)干細(xì)胞等。近年來，干細(xì)胞移植治療各種急慢性肝病已取得初步成果，但其利弊仍處于不斷的爭論之中。 肝星狀細(xì)胞是存在于肝內(nèi)Disse間隙的一類具有重要生理病理意義的肝臟間質(zhì)細(xì)胞。既往研究發(fā)現(xiàn)各種肝臟的急慢性病變都可促使其活化，形成肌纖維母細(xì)胞，分泌大量膠原蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)，影響肝臟正常的機(jī)能和代謝以及形態(tài)學(xué)上的變化。目前，文獻(xiàn)報道關(guān)于肝星狀細(xì)胞更多的生物學(xué)功能和胚胎來源尚不十分清楚，存在爭議。 我們的前期實驗發(fā)現(xiàn)肝星狀細(xì)胞表達(dá)某些干細(xì)胞標(biāo)記物。由此，我們設(shè)想肝星狀細(xì)胞是否具有一定潛在干細(xì)胞特性？其是否為肝內(nèi)的一類未完全分化的干/祖細(xì)胞群體，能否在某些條件下向肝內(nèi)實質(zhì)細(xì)胞分化？是否可對肝星狀細(xì)胞活化進(jìn)行干預(yù)，從而促使其參與肝細(xì)胞損傷后修復(fù)，而少發(fā)揮或不發(fā)揮促進(jìn)肝纖維化和肝硬化的形成的作用。 因此，本課題分以下幾個部分：1.肝星狀細(xì)胞的分離提取及鑒定。獲得原代大鼠肝星狀細(xì)胞并對提取細(xì)胞進(jìn)行特異性鑒定。2.肝星狀細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)記物的檢測。通過肝星狀細(xì)胞可能的胚胎來源，進(jìn)行不同的干細(xì)胞標(biāo)記物篩選檢測。3.肝星狀細(xì)胞體外誘導(dǎo)向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化的研究。通過建立體外誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞分化的培養(yǎng)體系，觀察原代肝星狀細(xì)胞通過多種細(xì)胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)是否能定向向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化。通過上述研究，旨在說明：1.原代肝星狀細(xì)胞表達(dá)某些干細(xì)胞標(biāo)記物。2.肝星狀細(xì)胞可通過體外誘導(dǎo)定向分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞。初步證明肝星狀細(xì)胞具有一定潛在的干細(xì)胞特性，其可能是肝內(nèi)的干/祖細(xì)胞群體。 方法 1.原代大鼠肝星狀細(xì)胞的分離提取取重約450-520g SD大鼠，分別采用原位肝灌注聯(lián)合離體肝灌注法和原位肝灌注法分離大鼠肝臟細(xì)胞，再采用60%Percoll通過密度梯度離心提取目的細(xì)胞。 2.原代大鼠肝星狀細(xì)胞鑒定包括肝星狀細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定，肝星狀細(xì)胞480nm激光下自發(fā)熒光鑒定，肝星狀細(xì)胞脂滴鑒定以及細(xì)胞特異性標(biāo)記物鑒定等。 3.檢測原代肝星狀細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)包括RT-PCR鑒定肝星狀細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)記物mRNA水平的表達(dá)，細(xì)胞免疫熒光鑒定肝星狀細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)記物蛋白水平的表達(dá)。 4.多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)原代大鼠肝星狀細(xì)胞向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化根據(jù)實驗分為二組，原代不加任何細(xì)胞因子培養(yǎng)24h的HSC為對照組，用bFGF20ug/L、FGF420ug/L、HGF20ug/L、IL-61ug/L等細(xì)胞因子誘導(dǎo)3天，然后用含F(xiàn)GF420ug/L培養(yǎng)基誘導(dǎo)4d的HSC為實驗組。 5. Realtime PCR和ICC檢測誘導(dǎo)前后肝星狀細(xì)胞表達(dá)肝細(xì)胞特異性基因和蛋白。 6. Realtime PCR和ICC檢測誘導(dǎo)前后肝星狀細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)記物mRNA和蛋白水平表達(dá)及變化。 結(jié)果 1.采用原位肝灌注聯(lián)合60%Percoll密度梯度離心法獲得的肝星狀細(xì)胞數(shù)量較多，達(dá)1.8×107/只大鼠，細(xì)胞活力≥90%。 2.提取的目的細(xì)胞最初為類圓形貼壁，培養(yǎng)7天后呈典型的肝星狀細(xì)胞形態(tài)，倒置顯微鏡下可見豐富脂滴呈“花環(huán)狀”圍繞核周，328nm激光下可見明顯的綠色熒光，尼羅紅脂滴染色呈陽性，特異性標(biāo)記物Desmin和GFAP細(xì)胞免疫熒光染色均陽性，細(xì)胞純度≥95%。 3.原代肝星狀細(xì)胞表達(dá)P75NTR、CD90、CD105、Dlk-1、c-kit、CD133、sox2、nanog、oct-4、lgr5等干細(xì)胞標(biāo)記物基因,并表達(dá)P75NTR、CD90、c-kit、sox-2、oct-4等干細(xì)胞標(biāo)記物蛋白。 4.原代肝星狀細(xì)胞經(jīng)過bFGF20ug/L、FGF420ug/L、HGF20ug/L、IL-61ug/L等細(xì)胞因子誘導(dǎo)后，與誘導(dǎo)前相比較，細(xì)胞形態(tài)呈肝細(xì)胞樣細(xì)胞為類圓形或多角形。 5.原代肝星狀細(xì)胞經(jīng)過bFGF20ug/L、FGF420ug/L、HGF20ug/L、IL-61ug/L等細(xì)胞因子誘導(dǎo)后，與誘導(dǎo)前相比較，轉(zhuǎn)錄水平出現(xiàn)肝細(xì)胞特異性標(biāo)記物ALB的表達(dá)(P＜0.01)和AFP的表達(dá)(P＜0.05)，細(xì)胞免疫熒光檢測蛋白水平變化與mRNA水平一致。 6.原代肝星狀細(xì)胞經(jīng)過bFGF20ug/L、FGF420ug/L、HGF20ug/L、IL-61ug/L等細(xì)胞因子誘導(dǎo)后，與誘導(dǎo)前相比較，肝星狀細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)記物P75NTR轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)下降(P＜0.05)，CD90、c-kit、sox-2、oct-4等轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)顯著下降(P＜0.01)，細(xì)胞免疫熒光檢測誘導(dǎo)前后干細(xì)胞標(biāo)記物蛋白水平明顯下降與基因水平表達(dá)一致。 結(jié)論 1.本研究方法可獲得較高數(shù)量和質(zhì)量的原代大鼠肝星狀細(xì)胞。 2.原代肝星狀細(xì)胞在mRNA水平和蛋白水平表達(dá)P75NTR、CD90、c-kit、sox-2、oct-4等干細(xì)胞標(biāo)記物，提示其可能具有某些潛在的干細(xì)胞特性。 3.原代肝星狀細(xì)胞經(jīng)過體外多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)可向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化，并表達(dá)肝細(xì)胞特異性標(biāo)記物AFP、ALB基因和蛋白。 4.原代肝星狀細(xì)胞經(jīng)過體外多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化過程中，伴有干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)下降，初步說明肝星狀細(xì)胞可能具有潛在干細(xì)胞分化特性，可能是肝內(nèi)一類具有分化潛能的干/祖細(xì)胞群。 5.本研究提供了一種短期內(nèi)利用bFGF、FGF4、HGF和IL-6等細(xì)胞因子聯(lián)合誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化的培養(yǎng)方法，為后續(xù)研究其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 6. P75NTR、CD90、c-kit、sox2、oct-4等干細(xì)胞標(biāo)記物可能為今后篩選具有干細(xì)胞特性的肝星狀細(xì)胞群體提供參考，為肝星狀細(xì)胞干細(xì)胞特性深入研究奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R575

【參考文獻(xiàn)】

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1 朱欣彥;王勝蘭;楊長青;楊文卓;張俊杰;孫龍娥;;大鼠肝星狀細(xì)胞的簡易分離法[J];同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2012年04期

本文編號：2652565