【摘要】：研究背景： 脂肪肝（liver steatosis or fatty liver）是各種病因造成脂肪代謝異常時最為常見的一種肝臟疾病，在我國約20%~30%的人患有脂肪肝。脂肪肝的典型病理變化是肝細胞內(nèi)過多中性脂肪（neutral lipid）儲積，并出現(xiàn)脂滴（lipiddroplet，LD）。目前對脂肪肝的病因研究較多，但對肝細胞內(nèi)脂滴代謝和形成的研究較少。脂滴（LD）早期被認為僅僅是一個類似于糖原的能量儲存結(jié)構(gòu)，但是目前研究表明，脂滴并非細胞內(nèi)一個簡單的能量貯存器，而是一個復雜的、活動旺盛、動態(tài)變化的多功能細胞成分。脂滴可能在脂類代謝與存儲、膜轉(zhuǎn)運、蛋白降解，以及信號傳導過程中均起著重要的作用。脂滴表面鑲嵌著多種脂滴蛋白（lipid droplet proteins，LDP），其對脂滴的穩(wěn)定性和代謝過程均具有非常重要的作用。目前，在所有脂滴蛋白中，PAT家族成員是最為重要，也是研究最多的一組分子。PAT家族主要包括perilipin、adipophilin、TIP47（tail-interacting protein of47kDa）、S3-12以及LSDP5（lipid storage droplet protein5）。其中LSDP5是PAT家族第五個成員，主要分布于脂肪分解代謝速度較快的組織中，如肝臟、心肌、骨骼肌等，因此又稱為OXPAT（oxidative tissue-enriched PAT protein）/PAT-1或MLDP（myocardial lipid droplet protein），但是其具體作用及機制目前尚不明確。 研究目的： 本研究擬確定LSDP5的亞細胞定位；通過構(gòu)建LSDP5的截短體，分析LSDP5各個結(jié)構(gòu)域的功能；確定LSDP5對肝細胞脂滴數(shù)量和大小、甘油三酯的合成和分解的影響，明確LSDP5對肝細胞脂肪代謝的作用；確定LSDP5的相互作用分子，分析LSDP5對脂滴代謝相關(guān)分子表達的影響，闡明LSDP5對肝脂肪代謝影響可能的分子機制。 研究方法： 1、利用免疫熒光的方法明確LSDP5在肝細胞內(nèi)的分布與亞細胞定位； 2、在肝細胞系和原代肝細胞中改變LSDP5的表達，觀察其對肝細胞脂滴形態(tài)和脂代謝的影響。 3、以LSDP5為誘餌蛋白，通過酵母雙雜交系統(tǒng)來篩選與之相互作用分子。并進一步通過免疫共沉淀和免疫熒光共定位驗證其相互作用，以相互作用的分子為線索，最終闡明LSDP5的分子功能。 研究結(jié)果： 1、LSDP5是一個脂滴表面蛋白（LDP）。使用免疫熒光技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)LSDP5定位在脂滴表面。構(gòu)建LSDP5截短體，，進一步研究發(fā)現(xiàn)LSDP5的N端，含有PAT家族保守性的PAT-1區(qū)和11-mer α-螺旋的重復序列，是LSDP5脂滴定位的關(guān)鍵部位。同時，細胞內(nèi)甘油三酯含量測定結(jié)果提示，LSDP5的N端也是影響脂滴儲積的關(guān)鍵區(qū)域。 2、LSDP5增加肝細胞內(nèi)中性脂肪的儲積。 在肝細胞內(nèi)過表達LSDP5，利用Nile Red熒光染料顯示肝細胞內(nèi)脂滴的形態(tài)和數(shù)量。結(jié)果表明LSDP5能夠明顯增加肝細胞內(nèi)大脂滴的比例，提高細胞內(nèi)甘油三酯的含量。LSDP5的沉默使細胞內(nèi)的脂滴增大受到明顯的抑制，胞漿內(nèi)脂滴明顯變小，肝細胞中甘油三酯含量也明顯降低。 3、 LSDP5可以影響脂肪分解和脂肪酸的氧化，并與具有脂肪分解作用的蛋白ES1（esterase1）存在相互作用。 LSDP5的沉默刺激脂肪分解，上調(diào)甘油三酯分解速率和脂肪分解相關(guān)酶的轉(zhuǎn)錄，增加脂肪酸β氧化速率和線粒體的數(shù)目。通過酵母雙雜交，我們篩選出了與LSDP5相互作用的分子ES1。ES1是一個在肝臟高表達的65KD的糖蛋白，它能夠水解許多的酯類，包括甘油三酯和其他的脂肪酸酯。進一步應(yīng)用免疫共沉淀和免疫熒光共定位，我們證明LSDP5能夠與ES1相互作用。 結(jié)論： 本研究證實LSDP5是一個定位于脂滴表面的蛋白質(zhì)，可以促進肝細胞內(nèi)脂滴的增大和甘油三酯的儲積。其機制可能是通過LSDP5與ES1的相互作用，抑制ES1對于甘油三酯的水解，并進一步減少脂肪酸的β氧化來實現(xiàn)的。抑制LSDP5的表達，可以有效減少肝細胞內(nèi)甘油三酯的儲積，因此LSDP5有望成為治療脂肪肝的新靶點。
【圖文】：

圖 1 脂滴的結(jié)構(gòu)（摘自參考文獻[7]）前我們還不清楚脂滴蛋白是如何定位在脂滴上的，這種定位是節(jié)。從概念上來說，含有親水的穿膜延伸結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)是不能單層膜表面的。定位在脂滴上的蛋白至少要滿足下述兩種結(jié)構(gòu)一，這種蛋白質(zhì)一定要有長的膜嵌入的結(jié)構(gòu)域，在磷脂單層的單層膜。典型的例子是微囊素（caveolins），它含有定位在質(zhì)膜結(jié)構(gòu)[17]；二酰甘油�；D(zhuǎn)移酶 2（DGAT2）也屬于此類[18]。第可以通過雙親性的螺旋結(jié)構(gòu)，作為一個膜蛋白結(jié)合到脂滴表面族蛋白（perilipin、adipophilin、S3-12、TIP47）[15]。然而最新許多脂滴蛋白，如甲基轉(zhuǎn)移酶 AAM-B（methyltransferases AAltransferase-like protein 7A）、ALD1 (associated with lipid droplet p似的 N 端疏水區(qū)。然而這些疏水結(jié)構(gòu)是否是這些脂滴蛋白定位機制還有待進一步研究證實[19]。更有趣的是，研究發(fā)現(xiàn)，包

第四軍醫(yī)大學博士學位論文1.2 脂滴的形成脂滴的生命周期開始于脂肪酸（fatty acid，F(xiàn)A）。細胞外白蛋白（albumin）和載脂蛋白（apolipoprotein）將脂肪酸帶到細胞表面。載脂蛋白中，脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，LPL）作用于甘油三酯（triglycerides，TG），使甘油三酯上的游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）釋放出來。游離脂肪酸借助脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白（fatty-acid transport proteins）或是脂肪酸異位酶（fatty-acidtranslocase）通過被動擴散的方式進入細胞內(nèi)[21]。同時，在許多類型的細胞內(nèi)，如肝臟，細胞可以利用糖類，通過從頭合成的方式生成脂肪酸（圖 2）。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R575.5

【共引文獻】

相關(guān)博士學位論文 前2條

1 王瑋;辛伐他汀對非酒精性脂肪性肝纖維化的影響及其分子機制[D];河北醫(yī)科大學;2011年

2 韋娜;膳食中不同n-6/n-3多不飽和脂肪酸構(gòu)成對乳腺癌發(fā)生發(fā)展的影響及分子機制研究[D];第三軍醫(yī)大學;2006年

本文編號：2651336