【摘要】：研究背景： 脂肪肝（liver steatosis or fatty liver）是各種病因造成脂肪代謝異常時(shí)最為常見(jiàn)的一種肝臟疾病，在我國(guó)約20%~30%的人患有脂肪肝。脂肪肝的典型病理變化是肝細(xì)胞內(nèi)過(guò)多中性脂肪（neutral lipid）儲(chǔ)積，并出現(xiàn)脂滴（lipiddroplet，LD）。目前對(duì)脂肪肝的病因研究較多，但對(duì)肝細(xì)胞內(nèi)脂滴代謝和形成的研究較少。脂滴（LD）早期被認(rèn)為僅僅是一個(gè)類似于糖原的能量?jī)?chǔ)存結(jié)構(gòu)，但是目前研究表明，脂滴并非細(xì)胞內(nèi)一個(gè)簡(jiǎn)單的能量貯存器，而是一個(gè)復(fù)雜的、活動(dòng)旺盛、動(dòng)態(tài)變化的多功能細(xì)胞成分。脂滴可能在脂類代謝與存儲(chǔ)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白降解，以及信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中均起著重要的作用。脂滴表面鑲嵌著多種脂滴蛋白（lipid droplet proteins，LDP），其對(duì)脂滴的穩(wěn)定性和代謝過(guò)程均具有非常重要的作用。目前，在所有脂滴蛋白中，PAT家族成員是最為重要，也是研究最多的一組分子。PAT家族主要包括perilipin、adipophilin、TIP47（tail-interacting protein of47kDa）、S3-12以及LSDP5（lipid storage droplet protein5）。其中LSDP5是PAT家族第五個(gè)成員，主要分布于脂肪分解代謝速度較快的組織中，如肝臟、心肌、骨骼肌等，因此又稱為OXPAT（oxidative tissue-enriched PAT protein）/PAT-1或MLDP（myocardial lipid droplet protein），但是其具體作用及機(jī)制目前尚不明確。 研究目的： 本研究擬確定LSDP5的亞細(xì)胞定位；通過(guò)構(gòu)建LSDP5的截短體，分析LSDP5各個(gè)結(jié)構(gòu)域的功能；確定LSDP5對(duì)肝細(xì)胞脂滴數(shù)量和大小、甘油三酯的合成和分解的影響，明確LSDP5對(duì)肝細(xì)胞脂肪代謝的作用；確定LSDP5的相互作用分子，分析LSDP5對(duì)脂滴代謝相關(guān)分子表達(dá)的影響，闡明LSDP5對(duì)肝脂肪代謝影響可能的分子機(jī)制。 研究方法： 1、利用免疫熒光的方法明確LSDP5在肝細(xì)胞內(nèi)的分布與亞細(xì)胞定位； 2、在肝細(xì)胞系和原代肝細(xì)胞中改變LSDP5的表達(dá)，觀察其對(duì)肝細(xì)胞脂滴形態(tài)和脂代謝的影響。 3、以LSDP5為誘餌蛋白，通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)來(lái)篩選與之相互作用分子。并進(jìn)一步通過(guò)免疫共沉淀和免疫熒光共定位驗(yàn)證其相互作用，以相互作用的分子為線索，最終闡明LSDP5的分子功能。 研究結(jié)果： 1、LSDP5是一個(gè)脂滴表面蛋白（LDP）。使用免疫熒光技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)LSDP5定位在脂滴表面。構(gòu)建LSDP5截短體，，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)LSDP5的N端，含有PAT家族保守性的PAT-1區(qū)和11-mer α-螺旋的重復(fù)序列，是LSDP5脂滴定位的關(guān)鍵部位。同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)甘油三酯含量測(cè)定結(jié)果提示，LSDP5的N端也是影響脂滴儲(chǔ)積的關(guān)鍵區(qū)域。 2、LSDP5增加肝細(xì)胞內(nèi)中性脂肪的儲(chǔ)積。 在肝細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)LSDP5，利用Nile Red熒光染料顯示肝細(xì)胞內(nèi)脂滴的形態(tài)和數(shù)量。結(jié)果表明LSDP5能夠明顯增加肝細(xì)胞內(nèi)大脂滴的比例，提高細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的含量。LSDP5的沉默使細(xì)胞內(nèi)的脂滴增大受到明顯的抑制，胞漿內(nèi)脂滴明顯變小，肝細(xì)胞中甘油三酯含量也明顯降低。 3、 LSDP5可以影響脂肪分解和脂肪酸的氧化，并與具有脂肪分解作用的蛋白ES1（esterase1）存在相互作用。 LSDP5的沉默刺激脂肪分解，上調(diào)甘油三酯分解速率和脂肪分解相關(guān)酶的轉(zhuǎn)錄，增加脂肪酸β氧化速率和線粒體的數(shù)目。通過(guò)酵母雙雜交，我們篩選出了與LSDP5相互作用的分子ES1。ES1是一個(gè)在肝臟高表達(dá)的65KD的糖蛋白，它能夠水解許多的酯類，包括甘油三酯和其他的脂肪酸酯。進(jìn)一步應(yīng)用免疫共沉淀和免疫熒光共定位，我們證明LSDP5能夠與ES1相互作用。 結(jié)論： 本研究證實(shí)LSDP5是一個(gè)定位于脂滴表面的蛋白質(zhì)，可以促進(jìn)肝細(xì)胞內(nèi)脂滴的增大和甘油三酯的儲(chǔ)積。其機(jī)制可能是通過(guò)LSDP5與ES1的相互作用，抑制ES1對(duì)于甘油三酯的水解，并進(jìn)一步減少脂肪酸的β氧化來(lái)實(shí)現(xiàn)的。抑制LSDP5的表達(dá)，可以有效減少肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯的儲(chǔ)積，因此LSDP5有望成為治療脂肪肝的新靶點(diǎn)。
【圖文】：

圖 1 脂滴的結(jié)構(gòu)（摘自參考文獻(xiàn)[7]）前我們還不清楚脂滴蛋白是如何定位在脂滴上的，這種定位是節(jié)。從概念上來(lái)說(shuō)，含有親水的穿膜延伸結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)是不能單層膜表面的。定位在脂滴上的蛋白至少要滿足下述兩種結(jié)構(gòu)一，這種蛋白質(zhì)一定要有長(zhǎng)的膜嵌入的結(jié)構(gòu)域，在磷脂單層的單層膜。典型的例子是微囊素（caveolins），它含有定位在質(zhì)膜結(jié)構(gòu)[17]；二酰甘油�；D(zhuǎn)移酶 2（DGAT2）也屬于此類[18]。第可以通過(guò)雙親性的螺旋結(jié)構(gòu)，作為一個(gè)膜蛋白結(jié)合到脂滴表面族蛋白（perilipin、adipophilin、S3-12、TIP47）[15]。然而最新許多脂滴蛋白，如甲基轉(zhuǎn)移酶 AAM-B（methyltransferases AAltransferase-like protein 7A）、ALD1 (associated with lipid droplet p似的 N 端疏水區(qū)。然而這些疏水結(jié)構(gòu)是否是這些脂滴蛋白定位機(jī)制還有待進(jìn)一步研究證實(shí)[19]。更有趣的是，研究發(fā)現(xiàn)，包

第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文1.2 脂滴的形成脂滴的生命周期開(kāi)始于脂肪酸（fatty acid，F(xiàn)A）。細(xì)胞外白蛋白（albumin）和載脂蛋白（apolipoprotein）將脂肪酸帶到細(xì)胞表面。載脂蛋白中，脂蛋白脂酶（lipoprotein lipase，LPL）作用于甘油三酯（triglycerides，TG），使甘油三酯上的游離脂肪酸（free fatty acid，F(xiàn)FA）釋放出來(lái)。游離脂肪酸借助脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（fatty-acid transport proteins）或是脂肪酸異位酶（fatty-acidtranslocase）通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散的方式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[21]。同時(shí)，在許多類型的細(xì)胞內(nèi)，如肝臟，細(xì)胞可以利用糖類，通過(guò)從頭合成的方式生成脂肪酸（圖 2）。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R575.5

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 王瑋;辛伐他汀對(duì)非酒精性脂肪性肝纖維化的影響及其分子機(jī)制[D];河北醫(yī)科大學(xué);2011年

2 韋娜;膳食中不同n-6/n-3多不飽和脂肪酸構(gòu)成對(duì)乳腺癌發(fā)生發(fā)展的影響及分子機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2006年

本文編號(hào)：2651336