【摘要】：肝纖維化是多種病因引起的慢性肝損傷所致的病理改變,表現(xiàn)為肝內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)成分過(guò)度沉積,基質(zhì)硬度增加,并影響肝臟功能,是慢性肝病發(fā)展到肝硬化的必經(jīng)階段。研究發(fā)現(xiàn),肝細(xì)胞在肝纖維化進(jìn)程中扮演重要角色,其凋亡、異常遷移和力學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)可啟動(dòng)、參與肝纖維化進(jìn)程。然而,目前對(duì)于基質(zhì)硬度變化與肝細(xì)胞功能的關(guān)系尚不明確,相關(guān)機(jī)制也不甚清楚。因此,本課題以肝細(xì)胞為研究對(duì)象,基質(zhì)硬度為研究條件,在二維/三維(2D/3D)尺度下探索不同基質(zhì)硬度對(duì)肝細(xì)胞生物學(xué)行為和力學(xué)特性的影響及其機(jī)制,主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下:(1)不同基質(zhì)硬度作用下肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)及生物信息學(xué)分析采用化學(xué)交聯(lián)法制備了硬度可調(diào)節(jié)的2D聚乙烯醇(polyvinyl alcohol,PVA)水凝膠基質(zhì),用于構(gòu)建體外細(xì)胞培養(yǎng)模型,實(shí)驗(yàn)所用軟(Soft)、中(Moderate)、硬(Stiff)三種基質(zhì)硬度分別模擬正常肝組織、肝纖維化早期和晚期肝組織硬度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不同硬度PVA基質(zhì)表面生長(zhǎng)的肝細(xì)胞,狀態(tài)良好,凋亡率低,同時(shí)可獲得高質(zhì)量的核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)并用于RNA-Seq檢測(cè)及生物信息學(xué)分析。對(duì)測(cè)序獲得的差異表達(dá)基因進(jìn)行基因分類(lèi)和信號(hào)通路富集分析,結(jié)果顯示不同基質(zhì)硬度影響肝細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡壞死、細(xì)胞肌動(dòng)蛋白骨架重排、細(xì)胞間連接、細(xì)胞-基質(zhì)互作、上皮-間質(zhì)表型轉(zhuǎn)換等生物功能和信號(hào)通路;通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)對(duì)相關(guān)差異表達(dá)基因進(jìn)行驗(yàn)證,基因定量結(jié)果與測(cè)序結(jié)果基本一致,提示RNA-Seq結(jié)果準(zhǔn)確度較高,具有參考意義;參考生物信息學(xué)分析的結(jié)果,下一步從實(shí)驗(yàn)水平考察不同2D基質(zhì)硬度對(duì)肝細(xì)胞功能的調(diào)控及機(jī)制。(2)不同2D基質(zhì)硬度對(duì)肝細(xì)胞生物學(xué)行為和力學(xué)特性的影響及機(jī)制借助于(1)中構(gòu)建的硬度可調(diào)節(jié)的體外細(xì)胞培養(yǎng)平臺(tái),探究2D不同基質(zhì)硬度對(duì)肝細(xì)胞形貌、凋亡壞死、遷移性能和力學(xué)特性的影響及機(jī)制。結(jié)果顯示,Stiff組可促進(jìn)肝細(xì)胞骨架重排、偽足產(chǎn)生及細(xì)胞極化;顯著性上調(diào)骨架相關(guān)蛋白F-actin和α-tubulin的表達(dá),顯著性下調(diào)肝細(xì)胞功能標(biāo)志蛋白Albumin的表達(dá);Stiff組可誘導(dǎo)β-連環(huán)蛋白(β-catenin)入核,進(jìn)而顯著上調(diào)肝細(xì)胞的死細(xì)胞比例,提示肝纖維晚期的病理硬度,可損害肝細(xì)胞功能、誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡�；|(zhì)硬度與裱襯蛋白濃度對(duì)單個(gè)肝細(xì)胞的遷移能力具有兩相調(diào)節(jié)作用,實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),裱襯有0.01mg/m L纖連蛋白(fibronection,FN)的Soft組上生長(zhǎng)的單個(gè)肝細(xì)胞具有最大的遷移軌跡、位移和速度;對(duì)融合肝細(xì)胞而言,細(xì)胞的遷移性能受基質(zhì)硬度和時(shí)間共同調(diào)節(jié),短時(shí)間內(nèi)(6 h),Soft組融合肝細(xì)胞遷移能力顯著增強(qiáng),長(zhǎng)時(shí)間段內(nèi)(48 h和72 h),Stiff組遷移能力顯著上調(diào)�；|(zhì)硬度調(diào)控單個(gè)和融合生長(zhǎng)肝細(xì)胞的楊氏模量和單個(gè)生長(zhǎng)細(xì)胞的應(yīng)力分布,原子力顯微鏡(atomic force microscope,AFM)檢測(cè)的融合生長(zhǎng)肝細(xì)胞的楊氏模量高于單個(gè)生長(zhǎng)肝細(xì)胞,Moderate組肝細(xì)胞具有最大楊氏模量;對(duì)Soft和Moderate組進(jìn)行有限元三維細(xì)胞模型分析的結(jié)果顯示,在相同均布力作用下,Soft和Moderate組細(xì)胞應(yīng)力分布相似,邊緣位置具有較大應(yīng)力分布,且Soft組最大Mises應(yīng)力顯著高于Moderate組。體內(nèi)外水平研究表明,不同基質(zhì)硬度可通過(guò)β-catenin介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞間連接和整合素-β1(Integrin-β1)介導(dǎo)的細(xì)胞-基質(zhì)間連接兩大系統(tǒng)的平衡互作,實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞楊氏模量的調(diào)節(jié),Moderate組細(xì)胞楊氏模量最大,認(rèn)為Moderate組基質(zhì)的硬度,較Soft和Stiff組而言,更為接近兩大黏附系統(tǒng)平衡的臨界值,在臨界值硬度的基質(zhì)上,細(xì)胞具有最大楊氏模量。(3)不同3D基質(zhì)硬度對(duì)肝細(xì)胞生物學(xué)功能的影響在(2)的研究基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探究3D基質(zhì)硬度對(duì)肝細(xì)胞生物學(xué)功能的影響,三種硬度分別與(2)中硬度相對(duì)應(yīng);結(jié)果表明,3D-Stiff組顯著性上調(diào)肝細(xì)胞的死細(xì)胞比例;3D不同基質(zhì)硬度對(duì)肝細(xì)胞的遷移無(wú)顯著影響。與2D中的結(jié)果類(lèi)似,3D-Stiff組可誘導(dǎo)β-catenin蛋白進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi),調(diào)控下游基因表達(dá)。本部分結(jié)果提示,3D-Stiff基質(zhì)模擬的肝纖維化晚期病理硬度可通過(guò)誘導(dǎo)肝細(xì)胞的凋亡加劇肝纖維化疾病進(jìn)程;同時(shí),3D-Stiff可誘導(dǎo)激活β-catenin的入核信號(hào)通路,為后續(xù)研究3D基質(zhì)硬度調(diào)節(jié)肝細(xì)胞凋亡壞死、遷移行為和力學(xué)特性變化的深入機(jī)制指明方向。綜上所述,本文成功構(gòu)建了模擬正常肝組織、肝纖維化早期和晚期肝組織硬度的體外細(xì)胞培養(yǎng)模型;發(fā)現(xiàn)了2D/3D Stiff基質(zhì)可能通過(guò)調(diào)控肝細(xì)胞骨架重排、極化、下調(diào)肝細(xì)胞功能標(biāo)志蛋白表達(dá)、上調(diào)肝細(xì)胞凋亡和遷移,參與肝纖維化疾病進(jìn)程,并初步證實(shí)Integrin-β1和β-catenin所介導(dǎo)的細(xì)胞-基質(zhì)間連接和細(xì)胞-細(xì)胞間連接的平衡互作,參與了不同基質(zhì)硬度對(duì)肝細(xì)胞力學(xué)特性變化的調(diào)節(jié)。本文的研究結(jié)果有助于深入認(rèn)識(shí)基質(zhì)硬度通過(guò)肝細(xì)胞功能調(diào)節(jié),影響肝纖維化疾病進(jìn)程的重要地位;同時(shí)從力學(xué)生物學(xué)的角度為臨床肝纖維化的治療提供新的研究視角和思路。
【圖文】：

圖 1.1 肝纖維化發(fā)病機(jī)制。在正常肝臟內(nèi)，肝臟具有微絨毛，肝星狀細(xì)胞儲(chǔ)存視黃醇。肝竇內(nèi)皮細(xì)胞上有窗孔。在各種病因的肝損傷進(jìn)程中，肝細(xì)胞喪失微絨毛并發(fā)生凋亡，由于肝竇內(nèi)皮細(xì)胞的缺乏，使得炎性細(xì)胞浸潤(rùn)于肝細(xì)胞。此外，kuffer 細(xì)胞被激活，誘發(fā)了肝星狀細(xì)胞的激活，導(dǎo)致大量 ECM 蛋白，包括原纖維膠原蛋白等，沉積在肝竇間隙內(nèi)[14]。Figure 1.1 Pathogenesis of liver fibrosis. In healthy liver, hepatocytes are studded with microvilli,HSCs store retinol and sinusoidal endothelial cells display fenestrae. During liver injury by a varietyof causes, hepatocytes lose microvilli and may undergo apoptosis. The sinusoidal endothelial cellsbecome devoid of fenestrae allowing inflammatory lymphocytes to infiltrate in the hepaticparenchyma. Furthermore Kupffer cells are activated, which in turn trigger HSC activation. As aresult, large amounts of ECM proteins, including fibrillar collagens, are deposited in the Space ofDisse[14].臨床上應(yīng)用最為普及的肝臟組織力學(xué)特性檢測(cè)手段，為超聲波瞬時(shí)彈性成像（transient elastography，TE）技術(shù)[19]。TE 技術(shù)的基本原理是（圖 1.2）: 在能夠產(chǎn)生和接收超聲波的換能器上裝有振蕩探頭，探頭可產(chǎn)生一個(gè)小振幅的低頻振蕩

2（A）基于超聲波瞬時(shí)彈性成像技術(shù)檢測(cè)肝硬度的原理。（B）正常肝臟無(wú)脂肪肝化（C）正常肝臟無(wú)脂肪肝有纖維化的 FibroScan 的圖像[19, 21]。ure1.2 (A) Principe of transient elastography used in liver stiffness measurement. Fibroes: (B) normal hepatic parenchyma without steatosis (C) hepatic parenchyma without stwith fibrosis[19, 21].由于肝組織內(nèi) ECM 的含量與其表觀的彈性系數(shù)存在相關(guān)性，該技術(shù)主要測(cè)肝纖維化和肝硬化，并能作為肝纖維化的分期指標(biāo)。臨床檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，值范圍在 2.4 到 75.4kPa 之間[22, 23]。通過(guò) TE 測(cè)定的肝硬度的正常值一般1.6 kPa，和年齡無(wú)關(guān)，但男性略高于女性（5.8 1.5 vs.5.2 1.6 kPa，p = 0文獻(xiàn)報(bào)道，一般E 7.0 kPa 為F0-F1期，7.0 kPa~9.5 kPa為F2期，，9.5 kPa為 F3 期， 12.5 kPa 為 F4 期，不同的疾病在分期上有一定的不同，oScan 提供的參考分期標(biāo)準(zhǔn)，TE 所測(cè)得的肝組織楊氏模量值和纖維化分在如圖 1.3 所示的聯(lián)系。
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R575.2

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本文編號(hào)：2651320