【摘要】：背景與目的:隨著生活方式及飲食結(jié)構(gòu)的改變,非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)作為代謝綜合征組成部分,現(xiàn)已成為影響世界人口達(dá)三分之一的最常見(jiàn)的肝臟疾病。NAFLD是由包括單純性肝脂肪變性、非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic Steatohepatitis,NASH)、肝纖維化、肝硬化和肝癌等一系列疾病組成[1]。研究表明,非酒精性肝炎(NASH)作為NAFLD重要進(jìn)展性病變,是導(dǎo)致肝硬化和肝癌的重要病因之一[2]。因此,早期預(yù)防及治療NASH對(duì)于預(yù)防肝硬化和肝癌顯得尤為重要,但是目前尚無(wú)對(duì)NASH著實(shí)有效的防治方法。高脂血癥是NASH的重要致病因素之一,既往研究顯示,NASH病人血清中含有高濃度的游離脂肪酸,其與疾病的嚴(yán)重程度及進(jìn)展高度相關(guān)[3]。另有研究表明,在NASH病人及小鼠NASH模型中可見(jiàn)到較為明顯的肝細(xì)胞凋亡,其作為NASH的一個(gè)重要的形態(tài)學(xué)和病理學(xué)標(biāo)志,與肝損傷的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[4,5]。因此,研究高脂誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡可能是解決或治療NASH的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶(Fatty acid translocase,FAT/CD36)廣泛分布于單核巨噬細(xì)胞,脂肪細(xì)胞等多種細(xì)胞表面,屬于清道夫受體B家族,可以與多種配體結(jié)合,如長(zhǎng)鏈脂肪酸(LCFA)和氧化性低密度脂蛋白(oxLDL)等。在人的正常肝臟中CD36含量較低,但在NAFLD患者的肝臟組織中CD36表達(dá)顯著增加[6,7]。前期研究發(fā)現(xiàn),肝臟LCFA的攝取及脂質(zhì)積聚與CD36有直接關(guān)系[8]。但目前尚不明確CD36是否參與了NAFLD病變中的肝細(xì)胞凋亡。因此,本文擬通過(guò)體內(nèi)外模型探討CD36的表達(dá)及棕櫚�；揎椩诟渭�(xì)胞凋亡的作用,并初步探討其相關(guān)分子機(jī)制。方法:第一部分:體內(nèi)實(shí)驗(yàn),以C57BL/6J小鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,將其隨機(jī)分兩組,分別給予正常飲食(NCD)和高脂飲食(HFD)22周,建立小鼠NASH模型。體外實(shí)驗(yàn),將HepG2細(xì)胞分為兩組,不給予PA組(含0.2%BSA的DMEM培養(yǎng)基)和給予PA組(含0.2%BSA的DMEM培養(yǎng)基+PA),以上共處理24h。收集小鼠血清,ELISA法檢測(cè)肝損傷轉(zhuǎn)氨酶活性;HE染色觀察肝臟脂肪變性及炎癥水平;用Western Blot法檢測(cè)小鼠肝臟組織及HepG2細(xì)胞中CD36及相關(guān)凋亡蛋白(bcl-2 and bax等)等的表達(dá)水平;用TUNEL染色、caspase-3活性試劑盒、Annexin-V/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝臟組織和細(xì)胞的凋亡情況。第二部分:體內(nèi)實(shí)驗(yàn),對(duì)C57BL/6J小鼠隨機(jī)分組,通過(guò)尾靜脈注射2種慢病毒,第一組是對(duì)照組NC病毒(NC),第二組是野生型CD36過(guò)表達(dá)病毒(CD36OE),給予兩組小鼠HFD喂養(yǎng)8周,構(gòu)建超表達(dá)CD36的小鼠模型。在HepG2細(xì)胞上,用表達(dá)NC和野生型CD36(CD36OE)的慢病毒感染細(xì)胞,建立超表達(dá)HepG2穩(wěn)定細(xì)胞系。另用小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染HepG2,構(gòu)建低表達(dá)CD36的HepG2細(xì)胞。用Q-PCR鑒定CD36的干擾效果,運(yùn)用Annexin-V/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)干擾后HepG2細(xì)胞凋亡情況。第三部分:體外實(shí)驗(yàn),慢病毒構(gòu)建CD36棕櫚�；稽c(diǎn)突變(AA-SS)的HepG2細(xì)胞系。ABE法鑒定CD36棕櫚�；潭�;用Western Blot法檢測(cè)bcl-2、p-bcl2等的凋亡通路蛋白的表達(dá)水平;用caspase-3活性試劑盒檢測(cè)相應(yīng)活性;用染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)bcl-2組蛋白乙�；�。結(jié)果:第一部分:小鼠肝臟石蠟切片進(jìn)行HE染色,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與NCD相比,HFD組:肝細(xì)胞脂肪變性及大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);血清肝功能轉(zhuǎn)氨酶增強(qiáng),提示有肝臟損傷;提取肝臟組織蛋白,Western Blot顯示CD36表達(dá)增加;TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞增多;caspase-3活性增加,bax表達(dá)增加(P0.05)。體外實(shí)驗(yàn)棕櫚酸處理HepG2細(xì)胞,流式凋亡細(xì)胞增加,caspase-3活性增加,TUNEL染色增加,bax表達(dá)增加,bax在線粒體表達(dá)增加,bcl-2表達(dá)減少,bcl-2磷酸化水平降低。以上結(jié)果提示高脂促進(jìn)肝臟細(xì)胞凋亡增加,CD36表達(dá)增加。第二部分:野生型CD36過(guò)表達(dá)的小鼠及HepG2細(xì)胞,Western Blot檢測(cè)小鼠肝臟組織和細(xì)胞中的CD36表達(dá)明顯增加,提示模型構(gòu)建成功。與NC組相比,CD36過(guò)表達(dá)促進(jìn)小鼠肝臟TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞增加,流式凋亡細(xì)胞增加,caspase-3活性增加。(P0.05)。進(jìn)一步,給予HepG2細(xì)胞CD36干擾后,流式檢測(cè)凋亡細(xì)胞明顯降低(P0.05)。從而提示肝細(xì)胞CD36表達(dá)增加與肝細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。第三部分:細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,PA處理可以促進(jìn)HepG2細(xì)胞的CD36棕櫚�；揎�;CD36棕櫚�；揎椏梢悦黠@促進(jìn)HepG2細(xì)胞的凋亡水平,同時(shí)抑制bcl-2蛋白的表達(dá)及磷酸化水平,促進(jìn)bax在線粒體中表達(dá)增加。染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果表明,抑制棕櫚酰化修飾可以明顯促進(jìn)bcl-2啟動(dòng)子乙�；磻�(yīng),從而促進(jìn)bcl-2轉(zhuǎn)錄,使得凋亡減少。結(jié)論:1.高脂飲食可以促進(jìn)NASH的發(fā)生,促進(jìn)CD36表達(dá),小鼠肝細(xì)胞凋亡增加;2過(guò)表達(dá)CD36后,肝細(xì)胞凋亡增加;而干擾CD36后肝細(xì)胞凋亡降低。3.棕櫚酸可以促進(jìn)CD36的棕櫚�；揎�;而抑制CD36棕櫚�；梢酝ㄟ^(guò)促進(jìn)bcl2的磷酸化及啟動(dòng)子乙�；磻�(yīng),促進(jìn)bcl-2轉(zhuǎn)錄,從而降低肝細(xì)胞凋亡的發(fā)生。
【圖文】：

計(jì)學(xué)方法究數(shù)據(jù)采用 SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均mean±SD）表示，兩處理組間采用獨(dú)立樣本均數(shù) t 檢驗(yàn)，以 P有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。飲食對(duì)小鼠肝臟功能的影響H 模型制作成功，收集給予普通飲食（NCD）和高脂飲食（鼠肝臟組織及血清，HE 染色如圖 1A，相比于 NCD 組，高脂肝臟空泡樣變性及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。同時(shí)血清肝功能轉(zhuǎn)氨酶指標(biāo)P<0.05,圖 1B）。提取肝臟組織的 mRNA，檢測(cè)炎癥指標(biāo) TN飲食明顯促進(jìn)了 TNF-α 的表達(dá)（P<0.05，圖 1C）。

TUNEL 染色檢測(cè)顯示 HFD 小鼠陽(yáng)性細(xì)胞明顯增加（圖2A），小鼠肝臟組織的 Caspase-3 的活性水平明顯增加（圖 2A），Q-PCR 結(jié)果提示促凋亡基因 bax 的表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以上結(jié)果均說(shuō)明高脂飲食可以促進(jìn)小鼠肝臟細(xì)胞凋亡的發(fā)生。圖 2 高脂喂養(yǎng)對(duì) C57BL/6J 小鼠肝臟凋亡影響Figure2 The effect of high fatty diet on mice liver.A.小鼠肝臟 TUNEL 染色 B.小鼠肝臟 caspase-3 活性檢測(cè) C. 小鼠肝臟bax mRNA 水平檢測(cè)。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（n≥6）*P<0.05 與 NCD 組比較。A．TUNEL staining on mice liver B. caspase-3 activity of mice liver C. thebax mRNA of mice liver. Results are expressed as mean ±SD（n≥6），，*P<0.05
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R575

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王偉芹;殷曉軒;王海彬;尹常健;王慧霞;;柔肝抑纖飲對(duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠肝細(xì)胞凋亡的影響[J];山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào);2006年03期

2 李文君;蔡紹暉;李校X;;放線菌素D誘導(dǎo)人離體HL7702肝細(xì)胞株凋亡及其作用機(jī)理[J];山東醫(yī)藥;2006年14期

3 程麗彩;何玉秀;;運(yùn)動(dòng)與肝細(xì)胞凋亡研究進(jìn)展[J];中國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)雜志;2006年05期

4 李澤信;劉江偉;張永久;馮德元;;NF-κB與肝細(xì)胞凋亡[J];中國(guó)現(xiàn)代普通外科進(jìn)展;2006年05期

5 楊欣榮,陳鐘;肝細(xì)胞移植中肝細(xì)胞凋亡的研究進(jìn)展[J];國(guó)外醫(yī)學(xué).外科學(xué)分冊(cè);2005年06期

6 張中樂(lè),劉金彪,權(quán)松霞;肝臟缺血再灌注損傷和肝細(xì)胞凋亡[J];河南科技大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2003年01期

7 張定鳳;第二講　肝細(xì)胞凋亡[J];中華消化雜志;1998年02期

8 王玉梅;馮國(guó)和;竇曉光;劉德剛;;小鼠暴發(fā)性肝衰竭肝細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)及其調(diào)控機(jī)制[J];世界華人消化雜志;2005年22期

9 王玉梅,馮國(guó)和,李穎,趙桂珍,喬光彥;實(shí)驗(yàn)性暴發(fā)性肝衰竭中腫瘤壞死因子α與肝細(xì)胞凋亡的關(guān)系[J];中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2002年06期

10 魏紅山,李定國(guó),陸漢明,王志榮;肝細(xì)胞凋亡的機(jī)制及藥物干預(yù)研究進(jìn)展[J];實(shí)用肝臟病雜志;1999年04期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 郭紅輝;劉國(guó)凌;劉永吉;周小偉;唐夕嵐;;花色苷通過(guò)改善線粒體功能預(yù)防高糖引起的肝細(xì)胞凋亡[A];第十二屆全國(guó)營(yíng)養(yǎng)科學(xué)大會(huì)論文匯編[C];2015年

2 汪紀(jì)倉(cāng);卞建春;劉學(xué)忠;袁燕;劉宗平;;氧化應(yīng)激在鎘致大鼠肝細(xì)胞凋亡中的作用[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2010年學(xué)術(shù)年會(huì)——第二屆中國(guó)獸醫(yī)臨床大會(huì)論文集(上冊(cè))[C];2010年

3 翁銀標(biāo);高洪;楊建發(fā);趙汝;高利波;彭潔;敖平星;;內(nèi)毒素對(duì)肝細(xì)胞凋亡及Bcl-2表達(dá)的影響[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)獸醫(yī)病理學(xué)分會(huì)第十五次、中國(guó)病理生理學(xué)會(huì)動(dòng)物病生專(zhuān)業(yè)委員會(huì)第十四次學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集[C];2007年

4 張莉莉;馬曉欣;李旭;;血管緊張素Ⅱ?qū)Ω渭?xì)胞凋亡及焦亡的誘導(dǎo)作用[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十三次全國(guó)感染病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2014年

5 沈秀華;程五鳳;謝良民;孫建琴;李峰;馬琳;;維生素E、硒對(duì)急性肝損傷期肝細(xì)胞凋亡影響的研究[A];中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)第八屆微量元素營(yíng)養(yǎng)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2003年

6 徐凱進(jìn);李蘭娟;邢卉春;沈恬;盛吉芳;鄭樹(shù)森;;大鼠肝缺血再灌注損傷中肝細(xì)胞凋亡的研究[A];第十次浙江省中西醫(yī)結(jié)合肝病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2008年

7 陶艷艷;閆秀川;張風(fēng);劉成海;;丹酚酸A對(duì)肝細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用[A];第十一屆全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)理論學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2015年

8 李善妮;瞿樹(shù)林;;急性力竭運(yùn)動(dòng)對(duì)大鼠肝細(xì)胞凋亡的影響[A];湖南省生理科學(xué)學(xué)會(huì)2004年度學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要匯編[C];2004年

9 閆秀川;沈麗;周滔;劉成海;;丹參抗肝細(xì)胞凋亡活性成分的高內(nèi)涵篩選[A];第十八次全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合肝病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2009年

10 許樹(shù)長(zhǎng);程琦;張志強(qiáng);陳錫美;楊文卓;王勝蘭;王鋒;;COX-2及肝細(xì)胞凋亡在NASH發(fā)生中作用的實(shí)驗(yàn)研究[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第七次全國(guó)消化病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編（下冊(cè)）[C];2007年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前1條

1 ;古藺肝蘇與肝細(xì)胞凋亡[N];健康報(bào);2007年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 趙毅;正常及脂肪變小體積肝移植缺血再灌注損傷的治療策略[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2004年

2 崔永澤;一氧化氮對(duì)大鼠梗阻性黃疸桿細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制[D];吉林大學(xué);2004年

3 秦建偉;線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換在大鼠肝臟缺血再灌注后肝細(xì)胞凋亡中的作用[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2006年

4 安永;大鼠體外循環(huán)后肝細(xì)胞損害及生長(zhǎng)激素上調(diào)STAT5信號(hào)通路的保護(hù)作用和機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2007年

5 孫曉艷;骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)大鼠肝臟缺血—再灌注損傷促修復(fù)作用的實(shí)驗(yàn)研究[D];吉林大學(xué);2008年

6 謝穎;線粒體損傷拮抗劑在Cr(Ⅵ)所致肝細(xì)胞凋亡中的保護(hù)作用[D];中南大學(xué);2014年

7 劉偉;乙型肝炎病毒核心蛋白(HBc)抑制Fas介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡及機(jī)制[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

8 金武丕;細(xì)胞凋亡相關(guān)基因及因素在大鼠酒精性肝病中的相關(guān)性研究[D];延邊大學(xué);2008年

9 刁志宏;乙型肝炎病毒P22～e蛋白經(jīng)核轉(zhuǎn)錄因子κB抑制肝細(xì)胞凋亡的研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2006年

10 李玉;奶牛酮病氧化應(yīng)激致肝細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制研究[D];吉林大學(xué);2014年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 張暢;脂肪酸轉(zhuǎn)位酶CD36的表達(dá)與棕櫚�；揎椩诟咧T導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡中的作用[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2018年

2 劉向;卵磷脂摻雜聚乳酸—聚氨酯納米纖維的制備及其對(duì)肝細(xì)胞活力的影響[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2018年

3 李維;高水平氯化亞錫對(duì)雛雞肝臟的影響[D];湖南農(nóng)業(yè)大學(xué);2017年

4 廖達(dá)林;非酒精性脂肪性肝病大鼠肝細(xì)胞凋亡及核因子-κB的活化[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2006年

5 冷汝溥;酒精性肝病大鼠血清腫瘤壞死因子與肝細(xì)胞凋亡的研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2004年

6 劉增權(quán);川芎嗪對(duì)大鼠肝細(xì)胞凋亡的影響[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2004年

7 孫健;Nrf2與肝細(xì)胞凋亡在非酒精性脂肪性肝病小鼠中的作用及相互關(guān)系[D];山東大學(xué);2011年

8 劉儀;慢性乙型肝炎患者肝細(xì)胞凋亡的研究[D];山東大學(xué);2009年

9 趙岳;內(nèi)皮素拮抗劑對(duì)梗阻性黃疸大鼠肝細(xì)胞凋亡的影響[D];吉林大學(xué);2004年

10 王春華;線粒體通透轉(zhuǎn)換孔與NAFLD肝細(xì)胞凋亡的關(guān)系[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2007年

本文編號(hào)：2651250