【摘要】：背景與目的:隨著生活方式及飲食結(jié)構(gòu)的改變,非酒精性脂肪性肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)作為代謝綜合征組成部分,現(xiàn)已成為影響世界人口達三分之一的最常見的肝臟疾病。NAFLD是由包括單純性肝脂肪變性、非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic Steatohepatitis,NASH)、肝纖維化、肝硬化和肝癌等一系列疾病組成[1]。研究表明,非酒精性肝炎(NASH)作為NAFLD重要進展性病變,是導(dǎo)致肝硬化和肝癌的重要病因之一[2]。因此,早期預(yù)防及治療NASH對于預(yù)防肝硬化和肝癌顯得尤為重要,但是目前尚無對NASH著實有效的防治方法。高脂血癥是NASH的重要致病因素之一,既往研究顯示,NASH病人血清中含有高濃度的游離脂肪酸,其與疾病的嚴(yán)重程度及進展高度相關(guān)[3]。另有研究表明,在NASH病人及小鼠NASH模型中可見到較為明顯的肝細胞凋亡,其作為NASH的一個重要的形態(tài)學(xué)和病理學(xué)標(biāo)志,與肝損傷的嚴(yán)重程度密切相關(guān)[4,5]。因此,研究高脂誘導(dǎo)的肝細胞凋亡可能是解決或治療NASH的一個潛在靶點。脂肪酸轉(zhuǎn)運酶(Fatty acid translocase,FAT/CD36)廣泛分布于單核巨噬細胞,脂肪細胞等多種細胞表面,屬于清道夫受體B家族,可以與多種配體結(jié)合,如長鏈脂肪酸(LCFA)和氧化性低密度脂蛋白(oxLDL)等。在人的正常肝臟中CD36含量較低,但在NAFLD患者的肝臟組織中CD36表達顯著增加[6,7]。前期研究發(fā)現(xiàn),肝臟LCFA的攝取及脂質(zhì)積聚與CD36有直接關(guān)系[8]。但目前尚不明確CD36是否參與了NAFLD病變中的肝細胞凋亡。因此,本文擬通過體內(nèi)外模型探討CD36的表達及棕櫚酰化修飾在肝細胞凋亡的作用,并初步探討其相關(guān)分子機制。方法:第一部分:體內(nèi)實驗,以C57BL/6J小鼠為實驗動物,將其隨機分兩組,分別給予正常飲食(NCD)和高脂飲食(HFD)22周,建立小鼠NASH模型。體外實驗,將HepG2細胞分為兩組,不給予PA組(含0.2%BSA的DMEM培養(yǎng)基)和給予PA組(含0.2%BSA的DMEM培養(yǎng)基+PA),以上共處理24h。收集小鼠血清,ELISA法檢測肝損傷轉(zhuǎn)氨酶活性;HE染色觀察肝臟脂肪變性及炎癥水平;用Western Blot法檢測小鼠肝臟組織及HepG2細胞中CD36及相關(guān)凋亡蛋白(bcl-2 and bax等)等的表達水平;用TUNEL染色、caspase-3活性試劑盒、Annexin-V/PI流式細胞術(shù)檢測肝臟組織和細胞的凋亡情況。第二部分:體內(nèi)實驗,對C57BL/6J小鼠隨機分組,通過尾靜脈注射2種慢病毒,第一組是對照組NC病毒(NC),第二組是野生型CD36過表達病毒(CD36OE),給予兩組小鼠HFD喂養(yǎng)8周,構(gòu)建超表達CD36的小鼠模型。在HepG2細胞上,用表達NC和野生型CD36(CD36OE)的慢病毒感染細胞,建立超表達HepG2穩(wěn)定細胞系。另用小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染HepG2,構(gòu)建低表達CD36的HepG2細胞。用Q-PCR鑒定CD36的干擾效果,運用Annexin-V/PI流式細胞術(shù)檢測干擾后HepG2細胞凋亡情況。第三部分:體外實驗,慢病毒構(gòu)建CD36棕櫚�；稽c突變(AA-SS)的HepG2細胞系。ABE法鑒定CD36棕櫚�；潭�;用Western Blot法檢測bcl-2、p-bcl2等的凋亡通路蛋白的表達水平;用caspase-3活性試劑盒檢測相應(yīng)活性;用染色質(zhì)免疫共沉淀實驗檢測bcl-2組蛋白乙�；�。結(jié)果:第一部分:小鼠肝臟石蠟切片進行HE染色,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與NCD相比,HFD組:肝細胞脂肪變性及大量炎性細胞浸潤;血清肝功能轉(zhuǎn)氨酶增強,提示有肝臟損傷;提取肝臟組織蛋白,Western Blot顯示CD36表達增加;TUNEL陽性細胞增多;caspase-3活性增加,bax表達增加(P0.05)。體外實驗棕櫚酸處理HepG2細胞,流式凋亡細胞增加,caspase-3活性增加,TUNEL染色增加,bax表達增加,bax在線粒體表達增加,bcl-2表達減少,bcl-2磷酸化水平降低。以上結(jié)果提示高脂促進肝臟細胞凋亡增加,CD36表達增加。第二部分:野生型CD36過表達的小鼠及HepG2細胞,Western Blot檢測小鼠肝臟組織和細胞中的CD36表達明顯增加,提示模型構(gòu)建成功。與NC組相比,CD36過表達促進小鼠肝臟TUNEL陽性細胞增加,流式凋亡細胞增加,caspase-3活性增加。(P0.05)。進一步,給予HepG2細胞CD36干擾后,流式檢測凋亡細胞明顯降低(P0.05)。從而提示肝細胞CD36表達增加與肝細胞凋亡密切相關(guān)。第三部分:細胞實驗結(jié)果顯示,PA處理可以促進HepG2細胞的CD36棕櫚�；揎�;CD36棕櫚酰化修飾可以明顯促進HepG2細胞的凋亡水平,同時抑制bcl-2蛋白的表達及磷酸化水平,促進bax在線粒體中表達增加。染色質(zhì)免疫共沉淀結(jié)果表明,抑制棕櫚酰化修飾可以明顯促進bcl-2啟動子乙�；磻�(yīng),從而促進bcl-2轉(zhuǎn)錄,使得凋亡減少。結(jié)論:1.高脂飲食可以促進NASH的發(fā)生,促進CD36表達,小鼠肝細胞凋亡增加;2過表達CD36后,肝細胞凋亡增加;而干擾CD36后肝細胞凋亡降低。3.棕櫚酸可以促進CD36的棕櫚酰化修飾;而抑制CD36棕櫚�；梢酝ㄟ^促進bcl2的磷酸化及啟動子乙酰化反應(yīng),促進bcl-2轉(zhuǎn)錄,從而降低肝細胞凋亡的發(fā)生。
【圖文】：

計學(xué)方法究數(shù)據(jù)采用 SPSS22.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)用均mean±SD）表示，兩處理組間采用獨立樣本均數(shù) t 檢驗，以 P有統(tǒng)計學(xué)意義。飲食對小鼠肝臟功能的影響H 模型制作成功，收集給予普通飲食（NCD）和高脂飲食（鼠肝臟組織及血清，HE 染色如圖 1A，相比于 NCD 組，高脂肝臟空泡樣變性及炎癥細胞浸潤。同時血清肝功能轉(zhuǎn)氨酶指標(biāo)P<0.05,圖 1B）。提取肝臟組織的 mRNA，檢測炎癥指標(biāo) TN飲食明顯促進了 TNF-α 的表達（P<0.05，圖 1C）。

TUNEL 染色檢測顯示 HFD 小鼠陽性細胞明顯增加（圖2A），小鼠肝臟組織的 Caspase-3 的活性水平明顯增加（圖 2A），Q-PCR 結(jié)果提示促凋亡基因 bax 的表達增加，差異有統(tǒng)計學(xué)均有統(tǒng)計學(xué)意義，以上結(jié)果均說明高脂飲食可以促進小鼠肝臟細胞凋亡的發(fā)生。圖 2 高脂喂養(yǎng)對 C57BL/6J 小鼠肝臟凋亡影響Figure2 The effect of high fatty diet on mice liver.A.小鼠肝臟 TUNEL 染色 B.小鼠肝臟 caspase-3 活性檢測 C. 小鼠肝臟bax mRNA 水平檢測。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示（n≥6）*P<0.05 與 NCD 組比較。A．TUNEL staining on mice liver B. caspase-3 activity of mice liver C. thebax mRNA of mice liver. Results are expressed as mean ±SD（n≥6），，*P<0.05
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R575

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本文編號：2651250