【摘要】：[目的]1.采用小鼠自由飲用DSS溶液法構建炎癥性腸病急、慢性動物模型,為臍帶間充質干細胞(UCMSC)治療IBD的療效與機制研究提供實驗對象。2.評價不同來源UCMSC、不同途徑注入的UCMSC對炎癥性腸病的療效和機制,為UCMSC臨床治療IBD提供理論依據和方法。[方法]1、UCMSC的制備:1.KM小鼠UCMSC:取KM孕鼠3只,采用頸椎脫臼法處死,剖腹,取臍帶,剔除被膜、血液等;剪成體積小于1mm3組織塊,接種于T25培養(yǎng)瓶底,置于5%C02培養(yǎng)箱內。待UCMSC生長至80%-90%融合時,按1:3傳代。2.人UCMSC:由干細胞與免疫細胞生物醫(yī)藥技術國家地方聯(lián)合工程實驗室提供的P2代細胞,按1:3傳代。分別對人和鼠P3UCMSC進行流式細胞儀分析UCMSC標志抗原陽性表達率,分析UCMSC成骨、成脂、成軟骨分化能力。將P3細胞用凍存液稀釋成3×106/mL,液氮貯存?zhèn)溆�。使用時,用生理鹽水將 UCMSC 稀釋成 5×106/ml 和 1×107/ml。2、IBD動物模型的建立:①急性模型:健康雄性C57BL/6小鼠(鼠齡:7-8w;體重20-22g)自由飲用3%DSS水溶液七天后,處死小鼠取材。②慢性模型:小鼠自由飲用3%DSS溶液5天,間隔10天后,按照“每隔三天持續(xù)飲用DSS溶液4天”循環(huán)5次后,處死小鼠并采集相關標本。造模期間,每天監(jiān)測小鼠體重、糞便形態(tài)、便血以及死亡率等指標;造模結束后,對結腸組織進行HE染色,觀察結腸組織學變化,同時行組織病理學評分。3、UCMSC移植治療小鼠IBD(1)不同途徑注射人UCMSC治療急性IBD模型:按上述方法制作急性IBD模型36只,將其隨機平均分成模型組、腹腔注射UCMSC組、靜脈注射UCMSC組,每組12只,同時設正常對照組9只。UCMSC靜脈注射組和腹腔注射組分別在造模開始后的第1、3、5天注射濃度為5×106/ml的UCMSC懸液100ul,模型組同步注入等量生理鹽水。于造模開始后的第七天處死小鼠取材。(2)UCMSC治療慢性IBD模型:取健康雄性C57BL/6小鼠,按上述方法制作急性IBD模型45只,然后將其隨機平均分成模型組、鼠UCMSC組、人UCMSC組,每組15只;同時設正常對照組9只。鼠UCMSC治療組和人UCMSC治療組經腹腔分別注射鼠UCMSC與人UCMSC(細胞濃度為1×107/ml;100ul),模型組小鼠腹腔注射等體積生理鹽水。于造模開始后的第50天處死小鼠取材。(3)觀察指標:①小鼠結腸組織結構;②血清中IL-6、TNF-a的濃度;炎癥細胞免疫組化染色;③結腸組織中杯狀細胞染色;④結腸組織中膠原纖維染色。⑤小鼠每天的精神狀態(tài)與體重;⑥糞便形態(tài);⑦便血情況;⑧結腸組織中Claudin-1、Occludin、IL-6基因相對表達量;VEGF-A、VEGFR-1、Occludin蛋白表達量。4、臍帶間充質干細胞對IBD作用機制分析采用Western blot實驗法檢測結腸組織中自噬標志蛋白LC3A/B、緊密連接蛋白Occludin、血管內皮生長因子VEGF-A體VEGFR-1達;qPCR法分析緊密連接蛋白Claudin-1、Occludin、炎癥因子IL-6的表達;采用GFP標記UCMSC與免疫組化法觀察UCMSC在體內的分布。[結果]1.UCMSC 鑒定人源與KM鼠源的UCMSC均呈纖維狀,貼壁生長。KM鼠源UCMSC標志物CD 105、CD90表達率分別為99.9%、100%;而CD34的表達率為0.239%,人源UCMSC標志物CD73、CD90、CD105 表達率分別為 97.5%、98.2%、97.5%;CD34、HLA-DR、CD45+的表達率分別為0.861%、2.22%、0.695%。兩種UCMSC均可被誘導分化為類脂肪細胞、骨樣、軟骨樣細胞。2.模型創(chuàng)建與評價IBD急性模型:小鼠在飲用3%DSS溶液4天后,出現(xiàn)便血,5天后體重開始下降,便血加重,精神萎靡,嗜睡懶動,聚集。大體解剖:可見小鼠全結腸或部分結腸有充血水腫、潰瘍。組織病理與染色示:腸上皮結構破壞、腺體紊亂、杯狀細胞減少,腸壁全層有大量膠原纖維沉積。慢性IBD模型,小鼠表現(xiàn)為間斷便血,體重維持在較低水平(為最初體重的85%左右),炎癥細胞浸潤腸壁各層,腺體樣結構幾乎消失,腸腔狹窄。3.UCMSC 療效(1)UCMSC治療急性IBD的療效:觀察期間內,腹腔注射UCMSC組、靜脈注射UCMSC組、模型組的體重下降百分比分別為:11%、14%、17%。腹腔注射UCMSC組、靜脈注射UCMSC組、模型組各組死亡率分別為:0%、8.3%、33%。IL-6在腹腔注射UCMSC組、靜脈注射UCMSC組、模型組中的血清濃度分別為:27.17±1.48(pg/ml)、71.11 ±9.19(pg/ml)、104.90±9.78(pg/ml)(p0.05)。TNFa在腹腔注射UCMSC組、靜脈注射UCMSC組、模型組中的血清濃度分別為:119.50±12.33、153.67±1.50、174.92 ±7.72(pg/ml)(p0.05)。qPCR 結果提示,腹腔注射UCMSC組的Claudin1、occludin較其他三組的表達增加(p0.05)。正常對照組、腹腔注射治療組、靜脈注射治療組、模型組的組織病理學評分分別為0.5±0.30;5.9±1.10;8.7±1.39;8.8± 1.33(p0.05)。(2)人和KM鼠UCMSC治療慢性IBD的療效:人和KM鼠UCMSC組、模型組的死亡率分別為:0%、13.3%、60%。人和KM鼠UCMSC組的結腸組織中的CD4+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞浸潤較少,與正常對照組接近,而模型組則呈彌漫性浸潤。人UCMSC治療組與KM鼠UCMSC治療組結腸組織中的杯狀細胞分布更均勻,密度更大,顏色深染,膠原纖維滲出較少,模型組情況與之相反。LC3A/B在人、KM鼠UCMSC組中的蛋白表達量低于其他兩組;VEGF-A、VEGFR-1與Occludin蛋白的表達在人UCMSC治療組中表達升高�！窘Y論]1、采用組織塊培養(yǎng)法成功獲得了 KM小鼠UCMSC細胞,UCMSC高表達CD90、CD105,低表達 CD34。人 UCMSC 高表達 CD73、CD90、CD105;低表達 CD34、CD45、HLA-DR。KM小鼠與人的UCMSC均具有向骨、軟骨、脂質分化的潛能。2、采用連續(xù)或間斷自由飲用3%DSS溶液成功建立了 IBD急、慢性模型。3、腹腔注射與靜脈注射UCMSC治療IBD急性模型,均顯示有效,但腹腔注射療效優(yōu)于靜脈注射法。4、人源UCMSC與KM鼠源的UCMSC均能降低小鼠IBD模型的死亡率,減輕腸炎,提示兩種來源的UCMSC均有治療作用。5、UCMSC促進腸緊密連接蛋白Occludin表達;下調結腸組織的自噬標志性蛋白LC3A/B的表達;上調受損部位VEGF-A與VEGFR-1的表達。6、UCMSC注入體內后,在腸、肝、脾、肺、腎器官組織中均有分布,其中脾臟中的分布最多。
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增長速度加快，成纖維狀的細胞成群分布。傳代培養(yǎng)后，細胞逐漸均勻一致，增殖速逡逑度加快。復蘇人臍帶間充質干細胞（ｈＵＣＭＳＣ）邋Ｐ２并擴增培養(yǎng)至Ｐ３，細胞呈梭形，Ｐ２代人逡逑ＵＣＭＳＣ擴X椗嘌粒校澈�，细胞呈梭形，人ＵＣＭ衙略大又B∈螅眨茫停櫻緬澹ㄈ繽跡保╁義希祝灣義稀觥鰣義獻ⅲ海�、Ｂ分柄_校稀ⅲ校斃∈螅眨茫停櫻茫誨澹謾ⅲ姆直鷂校�、Ｐ３人ＵＣＭ丫捔x賢跡比�、鼠ＵＣＭ衙导{ば翁ǎ保埃板澹劐澹╁義希保踩耍眨茫停櫻糜朧螅眨茫停櫻玫拿庖弒硇灣義狹魘較赴醴治魷允救耍眨茫停櫻玫模茫模罰常兀模梗壩耄茫模保埃笛糶月史直鷥嘰錚梗罰澹擔�、９８．邋２％和９ＡP澹擔�，，辶x隙稅耍

本文編號：2651049