【摘要】：研究背景 重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)合并急性肺損傷(acute lung injury, ALI)起病急劇,病情進展兇險,常導(dǎo)致約30%-40%的死亡率。細胞因子和炎癥介質(zhì)的過度釋放增強肺微血管內(nèi)皮細胞的通透性而導(dǎo)致肺水腫是ALI主要病理機制之一。前B細胞克隆增強因子(pre-B-cell colony-enhancing factor, PBEF)是一種新發(fā)現(xiàn)與肺損傷發(fā)生密切相關(guān)的肽類激素。既往資料顯示,PBEF參與了多種肺損傷的病理過程,主要與增強肺微血管內(nèi)皮細胞的通透性而導(dǎo)致肺水腫的發(fā)生密切相關(guān)。但PBEF在SAP并發(fā)ALI發(fā)病機制中的作用未見報道,本實驗在國內(nèi)外首次對其進行研究。 第一部分血清PBEF水平與重癥急性胰腺炎并發(fā)急性肺損傷的相關(guān)性研究 目的：檢測SAP并發(fā)ALI或ARDS患者和輕癥急性胰腺炎患者血清樣本中PBEF、TNF-α和IL-8表達。 方法：收集19例SAP并發(fā)ALI、13例SAP并發(fā)ARDS及32例輕癥急性胰腺炎患者的血清樣本,采用雙夾心ELISA方法檢測血清樣本中PBEF、TNF-α和IL-8表達水平。比較分析PBEF、TNF-α和IL-8表達水平與SAP并發(fā)ALI進程的相關(guān)性。 結(jié)果： SAP并發(fā)ARDS和并發(fā)ALI患者血清中的PBEF檢測值顯著高于輕癥急性胰腺炎的患者,SAP并發(fā)ARDS患者的PBEF亦高于并發(fā)ALI患者的PBEF水平,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。同時檢測TNF-α和IL-8可以得到相似的結(jié)果,并且血清PBEF與TNF-α和IL-8水平具有正相關(guān)性(r=3.215,P=0.012；r=4.247,P=0.019)。 結(jié)論：SAP并發(fā)ALI或ARDS的患者血清中PBEF、TNF-α和IL-8的濃度較輕癥急性胰腺炎患者血清中高；且血清中PBEF的濃度與TNF-α和IL-8的濃度分別呈正相關(guān)。 第二部分PBEF在重癥急性胰腺炎并發(fā)急性肺損傷大鼠模型肺組織中的表達 目的：檢測SAP并發(fā)急性肺損傷的大鼠模型肺組織中PBEF、 TNF-α和IL-8中的表達水平。 方法：采用去氧膽酸鈉逆行注入大鼠胰膽管方法誘發(fā)構(gòu)建SAP并發(fā)ALI的動物模型。實驗大鼠隨機分為2組：假手術(shù)組(SHAM組),胰腺炎并發(fā)肺損傷組(ALI組),每組24只。通過檢測大鼠模型的血清胰淀粉酶、血氣分析和局部病理改變,確定SAP并發(fā)ALI的動物模型構(gòu)建是否成功；應(yīng)用肺損傷評分對SAP并發(fā)ALI的動物模型的肺臟進行病理組織學(xué)損傷評分；采用實時熒光定量PCR和Western blot方法檢測SAP并發(fā)ALI發(fā)生時肺臟組織中PBEF、TNF-α和IL-8mRNA和蛋白的表達水平。 結(jié)果：通過對大鼠模型的胰腺病理改變、胰淀粉酶和血氣分析結(jié)果分析提示成功建立的大鼠動物模型符合重癥急性胰腺炎的病理改變。分別在造模后4小時、8小時、12小時取標本觀察相應(yīng)數(shù)據(jù)。我們在光鏡下初步比較了SHAM組和ALI組實驗大鼠的肺組織病理改變結(jié)果發(fā)現(xiàn),SAP并急性肺損傷組的肺損傷評分在造模后4小時即可見升高,12小時內(nèi)逐漸升高差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；SAP并急性肺損傷組的肺濕/干比值明顯增加,并隨時間延長逐漸加重,較SHAM組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。我們運用熒光實時定量PCR檢測了PBEF、TNF-α和IL-8mRNA在相應(yīng)時間點SAP并發(fā)ALI模型肺臟組織中的表達情況。結(jié)果顯示：各時間點ALI組PBEF mRNA、TNF-α mRNA和IL-8mRNA表達較SHAM組顯著上調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。采用Western blot方法檢測了同一批標本中相同時間點的PBEF、TNF-α和IL-8蛋白的表達,結(jié)果顯示蛋白表達亦明顯增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論：從動物模型的肺組織水平觀察到了PBEF、TNF-α和IL-8三者在SAP并發(fā)急性肺損傷時表達增高。 第三部分PBEF介導(dǎo)人肺微血管內(nèi)皮細胞急性損傷的分子機制 目的：通過體外培養(yǎng)肺細胞肺微血管內(nèi)皮細胞(PMVEC),采用基因重組和轉(zhuǎn)染技術(shù),在PBEF過表達或抑制并細胞因子TNF-a刺激的條件下,觀察IL-1p、IL-6和IL-8表達水平的改變；同時,檢測在特異性抑制P38、ERK1/2、JNK和PI3K信號通路的條件下的表達改變,探討PBEF在SAP并發(fā)ALI中的作用分子機制。 方法：構(gòu)建pEGFP-N1-PBEF-EGFP過表達重組質(zhì)粒和慢病毒pLKO.1-PBEF-SiRNA干擾質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的PMVEC細胞,采用實時熒光定量PCR和Western blot方法檢測PBEFmRNA和蛋白表達水平；流式細胞儀檢測PBEF過表達對PMVEC細胞凋亡的影響。細胞因子TNF-α分別刺激pEGFP-N1-PBEF和pLKO.1-PBEF-SiRNA轉(zhuǎn)染的PMVEC細胞,采用實時熒光定量PCR和Western blot方法檢測IL-1β、IL-6和IL-8表達水平。進一步在分別阻斷P38(阻斷劑為U0126)、ERK(阻斷劑為SB203580)、JNK(阻斷劑為SP600125)和PI3K信號通路(阻斷劑為LY294002)條件下,TNF-a誘導(dǎo)PBEF過表達的PMVEC細胞,熒光定量PCR和Western Blot檢測IL-1β、IL-6和IL-8表達水平。 結(jié)果：(1)重組質(zhì)粒pEGFP-N1-PBEF酶切和測序鑒定結(jié)果顯示符合后續(xù)實驗的要求。轉(zhuǎn)染PBEF過表達載體后,PBEF表達水平明顯提高,其中mRNA水平為對照的10倍左右,較對照組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。流式細胞儀檢測結(jié)果顯示,PBEF過表達可以促進HPMEC發(fā)生細胞凋亡,較對照組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(2)TNF-α誘導(dǎo)和PBEF過表達載體轉(zhuǎn)染時,IL-1β、IL-6和IL-8表達明顯增強,且以10ng/mL濃度的TNF-α誘導(dǎo)后,IL-1β、IL-6和IL-8表達增強更明顯(P0.05)。(3)pLKO.1-PBEF-SiRNA轉(zhuǎn)染細胞后PBEF表達抑制率約為85%,PBEF siRNA能明顯抑制PBEF的表達,TNF-α誘導(dǎo)同時進行PBEF siRNA轉(zhuǎn)染后,PBEF可以對抗TNF-α的誘導(dǎo)作用,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。(4)用SB203580抑制P38通路后,IL-1β、IL-6和IL-8表達下降具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；PD98059抑制ERK通路后,IL-1β、IL-6和IL-8表達下降亦具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。用SP600125抑制JNK通路后僅IL-8表達水平下降比較明顯,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)；用LY294002抑制PI3K通路后,IL-1β、IL-6和IL-8表達變化差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論：1,在PMVEC中,TNF-α和PBEF有協(xié)同作用；2,本研究首次發(fā)現(xiàn)在PMVEC中PBEF可能主要通過P38和ERK通路進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而促進IL-1β、IL-6和IL-8表達。
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R576

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本文編號：2650573