【摘要】：背景和目的活化的肝星狀細胞(HSCs)是肝纖維發(fā)生過程中的關(guān)鍵細胞。誘導活化的HSCs細胞凋亡有助于逆轉(zhuǎn)肝纖維化。靜止期的HSCs細胞質(zhì)中含有豐富的脂滴。Plin 5是脂滴表面的包被蛋白,在維持哺乳動物細胞的脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用。然而,目前對HSCs激活狀態(tài)下Plin 5的作用機制知之甚少。在本報告中,體外培養(yǎng)大鼠原代HSCs(rHSC-primary),探索Plin 5在肝纖維化中的作用和機制。采用293T細胞包裝慢病毒系統(tǒng),產(chǎn)生病毒顆粒(pFLRu-PLIN 5),將其轉(zhuǎn)導到培養(yǎng)的大鼠原代HSCs中用于實驗。探討Plin5對活化的HSCs增殖的影響以及AMPK是否參與Plin 5調(diào)控細胞凋亡、自噬和線粒體功能障礙,為Plin 5誘導活化的HSCs細胞凋亡提供了新機制,為治療肝纖維化提供新的靶點。方法(1)分別從健康大鼠、C57BL/6J小鼠和NAFLD模型C57BL/6J小鼠中分離肝臟組織、內(nèi)臟脂肪和原代HSCs;體外培養(yǎng)細胞系大鼠HSC-T6和小鼠HSC-GRX;RT-PCR和免疫熒光實驗檢測各組織、細胞中Plin 5、Plin 1、Plin 2、Plin 3和HIG 2水平。(2)體外培養(yǎng)轉(zhuǎn)導pFLRu-PLIN5的rHSC-primary。熒光顯微鏡和MTS法觀察其增殖狀態(tài);Western blot測定α-SMA和膠原蛋白、測定Cyclin D1和p21水平。(4)用或不用ICE-蛋白酶抑制劑處理Plin 5過表達的rHSC-primary,Western blot檢測Bcl-2和Bax、caspase級聯(lián)酶水平和caspase-3活性。(5)使用不同濃度AICAR處理rHSC-primary 24小時。Western blot檢測AMPK的磷酸化、各組自噬相關(guān)基因ULK1和LC3的磷酸化水平。(6)分別用化合物C和氯喹預處理轉(zhuǎn)導pFLRu-PLIN5的rHSC-primary。MTS測定增殖細胞情況;Western blot評估caspase-3活性、AMPK的磷酸化、Bcl-2和Bax、Cyclin D1和p21水平。(7)pEGFP-LC3與pFLRu-PLIN5共轉(zhuǎn)導于rHSC-primary。在熒光顯微鏡下觀察LC3熒光斑點的百分比。(8)用或不用丙酮酸甲酯、ICE-樣蛋白酶抑制劑預處理pFLRu-PLIN5轉(zhuǎn)導的rHSC-primary。RT-PCR檢測PGC-1α水平;ATP測定試劑盒測定ATP水平;Western blot分析Caspase-3活性、AMPK水平、Bcl-2和Bax、Cyclin D1和p21水平。結(jié)果(1)Plin 5 mRNA水平在內(nèi)臟脂肪、靜息期HSCs、健康肝臟、D7-HSCs依次呈下降趨勢(P0.05)。與靜息狀態(tài)HSCs相比,活化HSCs中Plin 2水平下降超過50%(P0.05)。而Plin 1、Plin 3和HIG 2的mRNA水平在HSCs的兩種狀態(tài)下無明顯差異(P0.05)。與正常飲食組小鼠相比,高脂飲食喂養(yǎng)組的小鼠HSCs的Plin5和Plin2分別下降90%和40%(P0.05)。(2)鏡下和MTS法觀察發(fā)現(xiàn)Plin 5過表達的rHSC-primary活性降低、α-SMA和膠原蛋白的產(chǎn)生減少、Cyclin D1蛋白表達下降,p21蛋白表達升高(P0.05),細胞增殖受到抑制。(3)rHSC-primary中Plin 5過表達,下調(diào)Bcl-2,上調(diào)Bax,增加PARP、caspase-3和caspase-9水平(P0.05),其變化可被caspase蛋白酶抑制劑逆轉(zhuǎn)(P0.05)。(4)Plin 5過表達的rHSC-primary和經(jīng)過AICAR處理的rHSC-primary,AMPK磷酸化水平增加,AICAR劑量依賴性地增加LC3-II/LC3-I的比率(P0.05)。(5)化合物C預處理轉(zhuǎn)導pFLRu-PLIN5的rHSC-primary時發(fā)現(xiàn),化合物C消除了Plin5過表達誘導的HSCs細胞周期停滯和細胞凋亡作用(P0.05)。(6)rHSC-primary轉(zhuǎn)導pFLRu-PLIN5慢病毒后,p-AMPK、p-ULK1和LC3-II/LC3-I水平明顯增加(P0.05)。這些作用結(jié)果均可以被氯喹消除(P0.05)。(7)pFLRu-PLIN5轉(zhuǎn)導的rHSC-primary經(jīng)過pEGFP-LC3轉(zhuǎn)導后,LC3亮斑增加(P0.05)。(8)Plin 5過表達的rHSC-primary,p-AMPK、p21水平均增加,線粒體功能的調(diào)節(jié)因子PGC-1αmRNA、ATP、Cyclin D1與Bcl-2水平下降(P0.05)。而這些作用可以在補充ATP水平后恢復(P0.05)。結(jié)論Plin 5損傷線粒體的生物合成,降低ATP水平,激活AMPK信號通路,誘導HSCs的凋亡。
【圖文】：

15圖 1 Plin 5 表達水平隨 HSCs 的激活顯著降低real-time PCR 檢測來自大鼠(左，實體)和小鼠(右，空心)的不同組織或 HSCs 群中 Plin mRNA 水平。#與脂肪組織比較, P<0.05，§與靜止 HSCs 比較，，P<0.05,n=6。 real-time PCR 顯示培養(yǎng) 1 天和 7 天 HSCs 的 Plin 5 mRNA 水平。#與培養(yǎng) 1 天 HSCs 比, P<0.05，n=6。C.熒光免疫染色顯示培養(yǎng) 1 天和 7 天大鼠 HSCs 的 Plin 5 蛋白含量變化。

17圖 2 外源性 Plin 5抑制活化原代大鼠HSCs增殖A.Western blot (上圖) 和 real-time PCR(下圖)顯示原代大鼠 HSCS 慢病毒轉(zhuǎn)導效率。β-actin 為等量上樣對照。B.MTS 檢測原代大鼠 HSCs轉(zhuǎn)導 pFLRu-PLIN5后的增殖情況。數(shù)據(jù)以(x±s)表示對照組百分比。#與未處理細胞比較, P<0.05，n=3。C.Western blot 分析原代大鼠 HSCs 轉(zhuǎn)導 pFLRu-PLIN5 后纖維化生物標志物。# 與未處理細胞比較，P<0.05，n=3。D.Western blot 分析轉(zhuǎn)導 pFLRu-PLIN5 原代大鼠 HSCs 的 Cyclin D1 和 p21 等細胞周期相關(guān)蛋白。#與未處理細胞比較，P<0.05，n=3。β-actin 為等量上樣對照。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R575.2

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 MA Wei-guo;WANG Jie;BU Xiang-wei;ZHANG Hong-hong;ZHANG Jian-ping;ZHANG Xiao-xu;HE Yu-xi;WANG Da-li;ZHANG Zheng-ju;MENG Feng-xian;;Effects of Polygonum cuspidatum on AMPK-FOXO3α Signaling Pathway in Rat Model of Uric Acid-Induced Renal Damage[J];Chinese Journal of Integrative Medicine;2019年03期

2 Yenan Feng;Youyi Zhang;Han Xiao;;AMPK and cardiac remodelling[J];Science China(Life Sciences);2018年01期

3 許夢川;吳躍峰;李東明;;AMPK的功能調(diào)控及其與腫瘤之間的關(guān)系[J];生理科學進展;2018年01期

4 Jing Wang;Zhenyu Li;Li Gao;Yanshuang Qi;Haibo Zhu;Xuemei Qin;;The regulation effect of AMPK in immune related diseases[J];Science China(Life Sciences);2018年05期

5 趙偉;王耀光;王成盼;;運動改善AMPK的研究現(xiàn)狀[J];中國學校體育(高等教育);2018年02期

6 于辰曦;孫水;;AMPK在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展中的作用[J];生命的化學;2016年06期

7 Zhao-Ying Liu;Shun-Peng Hu;Qing-Rong Ji;Hai-Bo Yang;Dong-Hao Zhou;Fang-Fang Wu;;Sevoflurane pretreatment inhibits the myocardial apoptosis caused by hypoxia reoxygenation through AMPK pathway:An experimental study[J];Asian Pacific Journal of Tropical Medicine;2017年02期

8 方明珠;徐艷秋;;AMPK與肥胖相關(guān)性腎病[J];貴陽中醫(yī)學院學報;2016年06期

9 Jin Li;Liping Zhong;Fengzhong Wang;Haibo Zhu;;Dissecting the role of AMP-activated protein kinase in human diseases[J];Acta Pharmaceutica Sinica B;2017年03期

10 Suneng Fu;;From glucose sensing to a unified model of AMPK and m TOR regulation[J];Science Bulletin;2017年18期

相關(guān)會議論文 前10條

1 孫宏斌;;AMPK:new insights into an old molecule[A];第十四屆中國藥學會青年藥學論壇報告集[C];2018年

2 劉不悔;何偉明;;Hyperoside Attenuates Renal Aging Induced by Dgalactose via Regulation of AMPK-ULK1-mediated Autophagy.[A];中國中西醫(yī)結(jié)合學會腎臟疾病專業(yè)委員會2018年學術(shù)年會論文摘要匯編[C];2018年

3 曹勛紅;徐平;廖尉廷;閆景瑤;羅宮薇;鄒惟瑩;楊蓓;張大雷;吳磊;鄒挺;;AMPK對胚胎成纖維細胞干細胞基因表達的影響[A];中國生理學會張錫鈞基金第十三屆全國青年優(yōu)秀生理學學術(shù)論文綜合摘要、中國生理學會第十一屆全國青年生理學工作者學術(shù)會議論文摘要[C];2015年

4 趙明華;余海燕;王蘊紅;張雪琳;;運動前補糖對大鼠心肌AMPK激活的影響[A];第四屆（2016）全國運動生理與生物化學學術(shù)會議——運動·體質(zhì)·健康論文摘要匯編[C];2016年

5 陳蘇寧;Lai Xiaofeng;Zhang Jian;;Combined cancer therapy:all roads lead to AMPK[A];中華醫(yī)學會臨床藥學分會2014年全國學術(shù)會議論文匯編[C];2014年

6 李怡寧;胡濟安;;AMP-activated protein kinase (AMPK) protects necrosis via regulation of Keap1-PGAM5 complex[A];2015年浙江省醫(yī)學會病理學術(shù)年會論文匯編[C];2015年

7 楊敏;陳少賢;劉居理;劉曉穎;符永恒;張夢珍;林秋雄;朱杰寧;麥麗萍;單志新;余細勇;林曙光;;三七總皂苷通過調(diào)節(jié)AMPK抑制心肌細胞凋亡[A];第八屆海峽兩岸心血管科學研討會論文集[C];2011年

8 Paul M Vanhoutte;;SIRT1 and AMPK:the Seesaw Effect in Regulating Endothelial Sene-scence[A];第八屆海峽兩岸心血管科學研討會論文集[C];2011年

9 ;AMPK mediated an apoptotic response to combined effect of hypoxia stress and ER stress[A];2012全國發(fā)育生物學大會摘要集[C];2012年

10 ZHANG Jian-wei;MA Xiao-wei;DENG Rui-fen;DING Shan;GU Nan;GUO Xiao-hui;;Genetic variability in AMPKαl gene may have synergetic effect with smoking on risk of coronary artery disease in chinese type 2 diabetics[A];中華醫(yī)學會糖尿病學分會第十六次全國學術(shù)會議論文集[C];2012年

相關(guān)重要報紙文章 前5條

1 陳丹;激活一關(guān)鍵基因可延緩果蠅衰老進程[N];科技日報;2014年

2 ;探索心中的奧秘[N];健康報;2012年

3 實習生 程鳳;不愛鍛煉可能與基因缺失有關(guān)[N];科技日報;2011年

4 記者 李鵬;她在解構(gòu)蛋白“機器”[N];北京科技報;2011年

5 記者 佘崢;降血糖“百年神藥”秘密被發(fā)現(xiàn)[N];廈門日報;2016年

相關(guān)博士學位論文 前10條

1 吳佳妮;益氣活血方對缺血心肌細胞骨架相關(guān)蛋白及AMPK調(diào)節(jié)途徑影響的研究[D];北京中醫(yī)藥大學;2019年

2 張興;基于AMPK信號通路探究肺瘤平膏調(diào)控自噬影響肺癌進展的效應機制[D];北京中醫(yī)藥大學;2019年

3 王仁和;益糖康通過激活AMPK/SIRT-1信號通路對糖尿病心肌病的保護機制研究[D];遼寧中醫(yī)藥大學;2018年

4 董佳梓;基于AMPK通路探討針刺足三里調(diào)控脾虛大鼠肌細胞線粒體自噬機制的研究[D];遼寧中醫(yī)藥大學;2018年

5 苗志強;早期日糧能量水平調(diào)控肉仔雞小腸磷轉(zhuǎn)運的機理研究[D];山西農(nóng)業(yè)大學;2017年

6 宋海英;冬眠心肌AMPK/PGC-1α/PPARα/UCP2通路的作用及理氣活血中藥的干預效應研究[D];中國中醫(yī)科學院;2018年

7 郭旭光;PavA通過激活AMPK/mTOR通路誘導肺泡上皮細胞自噬在肺炎鏈球菌感染中的作用機制研究[D];南方醫(yī)科大學;2018年

8 孟一迪;Ca~(2+)/鈣調(diào)蛋白依賴性激酶Ⅱ調(diào)節(jié)AMP激活蛋白激酶靶向調(diào)控缺血性心臟病脂肪酸代謝的機制研究[D];華中科技大學;2017年

9 鐘娟;含笑內(nèi)酯富馬酸鹽激活PPAR-γ介導NF-κB和AMPK/mTOR通路對db/db鼠肝腎損害的保護作用[D];南方醫(yī)科大學;2018年

10 李政委;microRNA-135b表達沉默Ppm1e激活AMPK信號通路抑制人骨肉瘤細胞增殖[D];蘇州大學;2018年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 蘇興;化合物C7靶向RXRα激活AMPK信號通路誘導腫瘤細胞發(fā)生自噬性死亡的機制研究[D];廈門大學;2018年

2 殷雪翠;Perilipin 5通過調(diào)控AMPK信號通路誘導活化肝星狀細胞凋亡的機制[D];鄭州大學;2019年

3 耿蕊娟;基于AMPK/SIRT1/UCP2通路探討疏肝化滯膠囊對NAFLD大鼠肝臟氧化應激的影響[D];遼寧中醫(yī)藥大學;2018年

4 張英揚;AMPK/ULK1/Beclin1途徑介導番鴨呼腸孤病毒誘導Vero細胞自噬的機制研究[D];福建農(nóng)林大學;2018年

5 文榮;野艾蒿中黃酮和萜類化合物對HepG2細胞AMPK和LPIN1表達的影響[D];內(nèi)蒙古科技大學包頭醫(yī)學院;2016年

6 欒司琦;十味降糖散對糖尿病大鼠糖脂代謝、抗氧化作用及對肝臟、脂肪AMPKα表達的影響[D];西南大學;2018年

7 鄧蒂斯;補腎化痰法經(jīng)APN/AMPK信號通路治療肥胖PCOS的機制研究[D];成都中醫(yī)藥大學;2018年

8 鐘淇濱;異土木香內(nèi)酯通過AMPK信號通路抗肝癌作用研究[D];廣東藥科大學;2018年

9 靳文雨;迷走神經(jīng)肝支離斷對大鼠血糖血脂水平的影響及其與肝AMPK表達的關(guān)系[D];桂林醫(yī)學院;2018年

10 伍義蘭;二甲雙胍對大鼠肺纖維化模型肺組織中AMPK、LC3-Ⅱ表達的影響[D];遵義醫(yī)學院;2018年

本文編號：2650565