【摘要】： 近年來(lái)隨著人們生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變,非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的患病率日益增高,成為導(dǎo)致慢性肝病的重要原因之一,構(gòu)成日益嚴(yán)重的社會(huì)健康問(wèn)題。NAFLD包括一系列相互聯(lián)系的病理改變,從單純性脂肪肝、脂肪性肝炎,到肝纖維化和肝硬化,甚至可以進(jìn)展為肝細(xì)胞癌。目前認(rèn)為,NAFLD與肥胖、糖尿病、高脂血癥等代謝綜合征密切相關(guān),而高脂飲食是引起肥胖及其相關(guān)并存癥高發(fā)的重要原因。攝入含過(guò)多飽和脂肪的食物可以直接導(dǎo)致肝細(xì)胞的脂肪浸潤(rùn)及氧化損傷,但其確切的分子機(jī)制尚未明確。用高脂飼料喂養(yǎng)SD大鼠可以成功復(fù)制不同病變程度的NAFLD動(dòng)物模型。本研究采用蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)手段,系統(tǒng)分析了高脂飲食相關(guān)的NAFLD發(fā)生發(fā)展過(guò)程中肝臟蛋白質(zhì)表達(dá)譜的動(dòng)態(tài)變化,發(fā)掘了一批與NAFLD疾病進(jìn)程密切相關(guān)的功能蛋白質(zhì)群,結(jié)合生物信息學(xué)手段系統(tǒng)分析差異蛋白的功能和調(diào)控網(wǎng)絡(luò),從而為深入探討NAFLD發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 用高脂飼料喂養(yǎng)SD大鼠4周、12周和24周,肝臟病理分別表現(xiàn)為肝細(xì)胞脂肪變性、脂肪變性伴炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),以及脂肪變性伴炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)及輕度纖維化,分別與NAFLD的單純性脂肪肝(SS),脂肪肝合并非特異性炎癥(NSI)及脂肪性肝炎(NASH)這三個(gè)階段的病理表現(xiàn)相似。隨后,我們利用差異凝膠電泳技術(shù)(DIGE)分析了不同造模時(shí)間的正常組和模型組大鼠肝臟蛋白質(zhì)表達(dá)譜的差異,所得到的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)用MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè),共鑒定了95個(gè)差異蛋白,其中SS階段的差異蛋白53個(gè),NSI階段的差異蛋白42個(gè),NASH階段的差異蛋白49個(gè)。這些差異蛋白在功能上具有明顯的階段特異性。其中參與脂肪酸氧化的酶在SS階段明顯下調(diào),可能是造成該階段肝細(xì)胞脂肪變性的重要原因;多個(gè)參與線粒體呼吸鏈和氧化磷酸化的酶在NSI階段表達(dá)下調(diào),提示線粒體功能障礙在這一階段的重要作用;最后在NASH階段,多個(gè)細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)都明顯上調(diào),很可能與該階段肝細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能紊亂相關(guān)。進(jìn)一步對(duì)這些差異蛋白進(jìn)行相互作用網(wǎng)絡(luò)的分析發(fā)現(xiàn),多個(gè)差異蛋白的表達(dá)受到PPARα和C/EBPα這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控,隨后我們通過(guò)Western blot方法檢測(cè)到PPARα在疾病的三個(gè)階段都明顯下調(diào),而C/EBPα在SS和NSI階段明顯上調(diào),提示這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。此外,我們還發(fā)現(xiàn)4個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶(PDI,PDIA3,GRP78和ERp29)在進(jìn)展期NSI和NASH階段明顯上調(diào)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶表達(dá)上調(diào)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的一個(gè)重要特點(diǎn),資料顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在肥胖、2型糖尿病等代謝性疾病中均發(fā)揮了重要作用,為此推測(cè),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂所造成的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是促使NAFLD病程進(jìn)展的一個(gè)重要因素。上述研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明NAFLD發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,發(fā)現(xiàn)分期分型診斷標(biāo)志物和潛在的藥物靶點(diǎn)奠定了基礎(chǔ)。
【圖文】：

—暴一目前NAFLD發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制尚未完全明確。目前最具影響力的假說(shuō)是由D盯在1995年提出的“二次打擊”學(xué)說(shuō)“:由于胰島素抵抗(insulin:esistant，，IR)，引起外周脂肪分解和高胰島素血癥，導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性，此為一次打擊;脂肪變性的肝細(xì)胞對(duì)內(nèi)、外源性損害因子的敏感性增強(qiáng)，反應(yīng)性氧化代謝產(chǎn)物增多，導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化，伴細(xì)胞因子、線粒體解偶聯(lián)蛋白一2和Fas配體的誘導(dǎo)活化，進(jìn)而引起脂肪變性的肝細(xì)胞發(fā)生炎癥和壞死，此為二次打擊;除非能及時(shí)阻止炎癥一壞死循環(huán)，否則將進(jìn)一步進(jìn)展為肝纖維化和肝硬化。(圖1)7�？傊�，NAFLD的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素多步驟的復(fù)雜過(guò)程，具體涉及以下三個(gè)方面:

斷碑甲幽助內(nèi):0..甲朋幽時(shí)”圖3.2一 DDIGE技術(shù)的工作原理樣本用不同的熒光染料(CyZ，Cy3，Cys)進(jìn)行標(biāo)記，等量混合后在一張膠上進(jìn)行分離(圖3)。由于一張膠上可以同時(shí)分離三個(gè)樣品，大大減少了分析膠的數(shù)量，同時(shí)也減少了不同膠之間的匹配問(wèn)題，使重復(fù)性提高。其次，由于在每張膠中都引入了由所有樣品等量混合而成的內(nèi)標(biāo)，提高了每張膠之間對(duì)比的準(zhǔn)確性，解決了傳統(tǒng)2一DE技術(shù)膠與膠之間變異大的問(wèn)題”。此外，cy熒光染料具有較好的靈敏度和動(dòng)態(tài)范圍
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R575.5

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本文編號(hào)：2650325