【摘要】： 背景和目的: Barrett食管(BE)指食管下段鱗狀上皮細胞被柱狀上皮細胞替代。大多數(shù)食管腺癌發(fā)生在BE基礎上,而后者被認定為胃食管反流病(GERD)的并發(fā)癥。新近觀點認為胃酸與膽鹽是誘發(fā)具有遺傳傾向患者發(fā)生BE的環(huán)境因素,二者均可直接損傷食管粘膜上皮誘發(fā)BE發(fā)生,但具體分子發(fā)生機制尚不明確。最近的研究發(fā)現(xiàn)TGF-β家族中的BMP4可能參與這個過程,相對于正常食管粘膜,BMP4在食管炎與Barrett食管粘膜中的表達明顯上調(diào),并可以誘導正常食管鱗狀上皮細胞細胞角蛋白表達發(fā)生變化。實驗證明BMP4具有廣泛的作用,如誘導成骨、維持胚胎正常發(fā)育、誘導干細胞分化等等,但在BE表達上調(diào)的機制及意義尚不清楚。為此本課題的研究目的是研究酸與膽鹽對于正常食管鱗狀上皮細胞BMP4表達的影響,并探討在食管上皮腸化生過程中BMP4所發(fā)揮的作用及相關(guān)機制。 方法: 1.通過內(nèi)鏡檢查下取材、改良消化酶、應用完全KSFM培養(yǎng)基探索簡便易行的體外培養(yǎng)食管鱗狀上皮細胞(EECs)的方法;2.采用RT-PCR、real-time PCR、Western blot等方法,研究酸與膽鹽對EECs BMP4基因和蛋白表達的影響;3.采用細胞計數(shù)、Am-Blue法檢測重組人BMP4(rhBMP4)對于EECs增殖與活力的影響;4.采用RT-PCR、real-time PCR、Western blot等方法,檢測rhBMP4誘導的EECs Villin、CDX2 mRNA與蛋白合成的變化,以及BMP4特異性拮抗劑Noggin對于酸誘導EECs表達Villin蛋白效應的影響,以明確BMP4誘導食管上皮腸化生的作用;5.采用Western blot的方法,檢測rhBMP4對EECs Smad1活化水平和ID2蛋白表達水平的影響,以研究BMP信號通路在BMP4誘導腸化生中的作用。 結(jié)果: 1.內(nèi)鏡下取材方法簡便,并可獲得足夠活細胞。TrypLETM Express較胰酶純度高,對細胞損傷小。原代培養(yǎng)EECs以基底層細胞為主,混以少量分化層細胞,無成纖維細胞污染。長期傳代培養(yǎng)細胞仍保持良好形態(tài)與增殖能力。 2.正常EECs未檢測到BMP4 mRNA和蛋白表達。酸呈濃度與時間依賴性刺激BMP4 mRNA和蛋白表達,pH4.0效應最強并與pH7.2存在顯著性差異(P0.05)�；旌辖Y(jié)合膽鹽在pH7.2條件下輕度刺激BMP4表達(P0.05),在pH4.0條件下效應明顯增強(P0.05)。 3.rhBMP4呈濃度依賴抑制EECs增殖(P0.05)、降低細胞活力(P0.05),可能與BMP4促細胞凋亡有關(guān)。 4.正常EECs不表達腸化上皮標志物Villin、CDX2蛋白, rhBMP4可呈濃度依賴性促進細胞表達這兩種蛋白(P0.05)。 5.慢性酸暴露可明顯上調(diào)EECs Villin表達(P0.05),BMP4特異性拮抗劑Noggin可有效抑制這種效應(P0.05)。相對而言,短暫酸暴露對于Villin表達無影響。 6.rhBMP4可迅速活化EECs內(nèi)Smad1(P0.05),并呈時間依賴性增強ID2蛋白表達(P0.05)。但撤去rhBMP4 10分鐘后P-Smad1水平恢復正常。 結(jié)論: 1.采用內(nèi)鏡下取材、改良消化方法、應用完全K-SFM培養(yǎng)基可成功進行人EECs的原代和傳代培養(yǎng),并克服了傳統(tǒng)方法中所存在的細胞來源受限、易受成纖維細胞污染、細胞數(shù)量稀少、細胞傳代困難等問題。 2.胃酸從基因轉(zhuǎn)錄及蛋白合成水平上刺激EECs表達BMP4,并呈時間與濃度依賴性。單獨膽鹽的作用較弱,在胃酸存在條件下作用增強。提示胃酸可能是導致Barrett食管發(fā)生最重要的環(huán)境因素,而膽鹽則可能起到協(xié)同效應。 3.BMP4可抑制EECs增殖,促進EECs表達腸化上皮標志物Villin和CDX2。而BMP4拮抗劑Noggin可有效抑制酸誘發(fā)的EECs表達Villin蛋白。提示BMP4上調(diào)可能是食管上皮腸化生過程中的關(guān)鍵點。 4.BMP4可有效激活EECs內(nèi)Smad1,并促進ID2蛋白表達,提示BMP4通過激活胞內(nèi)的BMP通路參與BE的發(fā)生。
【圖文】：

約10 d后細胞開始融合成片，需要傳代。前5-6代細胞大小形態(tài)均一，，之后出現(xiàn)逐漸增多的巨形細胞，胞漿內(nèi)顆粒也隨之增多，第10代細胞仍保持良好形態(tài)與增殖能力，之后未再繼續(xù)傳代。見圖1。2．生長曲線：以1×104/ml接種于10ml培養(yǎng)瓶中，細胞群體倍增時間（DT）為(47.4± 2.8) h (n=3)。

多數(shù)培養(yǎng)細胞表現(xiàn)為CK14陽性染色
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R571;R735.1

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前6條

1 黃河 ,伍趕球 祝,繼明 ,陳慶林;肝細胞癌及癌旁組織中骨形態(tài)發(fā)生蛋白的免疫組織化學研究[J];中國醫(yī)師雜志;2002年04期

2 張茹,龔均,王暉,王利,雷娟,冉力偉;人正常食管黏膜上皮細胞的純化分離和傳代培養(yǎng)[J];第四軍醫(yī)大學學報;2005年16期

3 呂紅兵,金巖,Tipoe GL;軟骨腫瘤中骨形成蛋白的原位雜交定位和定量分析[J];實用腫瘤雜志;2000年04期

4 岳文,楊連甲,李鑫,董紹忠,晏偉,朱峰,張殿忠,范清宇;反義人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2基因逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體的構(gòu)建及其對骨肉瘤細胞生物學行為的影響[J];中華骨科雜志;2000年09期

5 房殿春;許同銘;趙晶京;;Barrett食管診治共識(草案,2005,重慶)[J];中華消化雜志;2006年02期

6 章翔,吳景文,李俠,付洛安,高大寬,白紅民,劉先珍;人骨形成蛋白-2和透明質(zhì)酸對腦膠質(zhì)細胞瘤侵襲性的影響[J];中華醫(yī)學雜志;2002年02期

本文編號：2649193