發(fā)布時(shí)間：2020-05-05 00:05

【摘要】： 背景和目的: Barrett食管(BE)指食管下段鱗狀上皮細(xì)胞被柱狀上皮細(xì)胞替代。大多數(shù)食管腺癌發(fā)生在BE基礎(chǔ)上,而后者被認(rèn)定為胃食管反流病(GERD)的并發(fā)癥。新近觀點(diǎn)認(rèn)為胃酸與膽鹽是誘發(fā)具有遺傳傾向患者發(fā)生BE的環(huán)境因素,二者均可直接損傷食管粘膜上皮誘發(fā)BE發(fā)生,但具體分子發(fā)生機(jī)制尚不明確。最近的研究發(fā)現(xiàn)TGF-β家族中的BMP4可能參與這個(gè)過(guò)程,相對(duì)于正常食管粘膜,BMP4在食管炎與Barrett食管粘膜中的表達(dá)明顯上調(diào),并可以誘導(dǎo)正常食管鱗狀上皮細(xì)胞細(xì)胞角蛋白表達(dá)發(fā)生變化。實(shí)驗(yàn)證明BMP4具有廣泛的作用,如誘導(dǎo)成骨、維持胚胎正常發(fā)育、誘導(dǎo)干細(xì)胞分化等等,但在BE表達(dá)上調(diào)的機(jī)制及意義尚不清楚。為此本課題的研究目的是研究酸與膽鹽對(duì)于正常食管鱗狀上皮細(xì)胞BMP4表達(dá)的影響,并探討在食管上皮腸化生過(guò)程中BMP4所發(fā)揮的作用及相關(guān)機(jī)制。 方法: 1.通過(guò)內(nèi)鏡檢查下取材、改良消化酶、應(yīng)用完全KSFM培養(yǎng)基探索簡(jiǎn)便易行的體外培養(yǎng)食管鱗狀上皮細(xì)胞(EECs)的方法;2.采用RT-PCR、real-time PCR、Western blot等方法,研究酸與膽鹽對(duì)EECs BMP4基因和蛋白表達(dá)的影響;3.采用細(xì)胞計(jì)數(shù)、Am-Blue法檢測(cè)重組人BMP4(rhBMP4)對(duì)于EECs增殖與活力的影響;4.采用RT-PCR、real-time PCR、Western blot等方法,檢測(cè)rhBMP4誘導(dǎo)的EECs Villin、CDX2 mRNA與蛋白合成的變化,以及BMP4特異性拮抗劑Noggin對(duì)于酸誘導(dǎo)EECs表達(dá)Villin蛋白效應(yīng)的影響,以明確BMP4誘導(dǎo)食管上皮腸化生的作用;5.采用Western blot的方法,檢測(cè)rhBMP4對(duì)EECs Smad1活化水平和ID2蛋白表達(dá)水平的影響,以研究BMP信號(hào)通路在BMP4誘導(dǎo)腸化生中的作用。 結(jié)果: 1.內(nèi)鏡下取材方法簡(jiǎn)便,并可獲得足夠活細(xì)胞。TrypLETM Express較胰酶純度高,對(duì)細(xì)胞損傷小。原代培養(yǎng)EECs以基底層細(xì)胞為主,混以少量分化層細(xì)胞,無(wú)成纖維細(xì)胞污染。長(zhǎng)期傳代培養(yǎng)細(xì)胞仍保持良好形態(tài)與增殖能力。 2.正常EECs未檢測(cè)到BMP4 mRNA和蛋白表達(dá)。酸呈濃度與時(shí)間依賴性刺激BMP4 mRNA和蛋白表達(dá),pH4.0效應(yīng)最強(qiáng)并與pH7.2存在顯著性差異(P0.05)�；旌辖Y(jié)合膽鹽在pH7.2條件下輕度刺激BMP4表達(dá)(P0.05),在pH4.0條件下效應(yīng)明顯增強(qiáng)(P0.05)。 3.rhBMP4呈濃度依賴抑制EECs增殖(P0.05)、降低細(xì)胞活力(P0.05),可能與BMP4促細(xì)胞凋亡有關(guān)。 4.正常EECs不表達(dá)腸化上皮標(biāo)志物Villin、CDX2蛋白, rhBMP4可呈濃度依賴性促進(jìn)細(xì)胞表達(dá)這兩種蛋白(P0.05)。 5.慢性酸暴露可明顯上調(diào)EECs Villin表達(dá)(P0.05),BMP4特異性拮抗劑Noggin可有效抑制這種效應(yīng)(P0.05)。相對(duì)而言,短暫酸暴露對(duì)于Villin表達(dá)無(wú)影響。 6.rhBMP4可迅速活化EECs內(nèi)Smad1(P0.05),并呈時(shí)間依賴性增強(qiáng)ID2蛋白表達(dá)(P0.05)。但撤去rhBMP4 10分鐘后P-Smad1水平恢復(fù)正常。 結(jié)論: 1.采用內(nèi)鏡下取材、改良消化方法、應(yīng)用完全K-SFM培養(yǎng)基可成功進(jìn)行人EECs的原代和傳代培養(yǎng),并克服了傳統(tǒng)方法中所存在的細(xì)胞來(lái)源受限、易受成纖維細(xì)胞污染、細(xì)胞數(shù)量稀少、細(xì)胞傳代困難等問(wèn)題。 2.胃酸從基因轉(zhuǎn)錄及蛋白合成水平上刺激EECs表達(dá)BMP4,并呈時(shí)間與濃度依賴性。單獨(dú)膽鹽的作用較弱,在胃酸存在條件下作用增強(qiáng)。提示胃酸可能是導(dǎo)致Barrett食管發(fā)生最重要的環(huán)境因素,而膽鹽則可能起到協(xié)同效應(yīng)。 3.BMP4可抑制EECs增殖,促進(jìn)EECs表達(dá)腸化上皮標(biāo)志物Villin和CDX2。而BMP4拮抗劑Noggin可有效抑制酸誘發(fā)的EECs表達(dá)Villin蛋白。提示BMP4上調(diào)可能是食管上皮腸化生過(guò)程中的關(guān)鍵點(diǎn)。 4.BMP4可有效激活EECs內(nèi)Smad1,并促進(jìn)ID2蛋白表達(dá),提示BMP4通過(guò)激活胞內(nèi)的BMP通路參與BE的發(fā)生。
【圖文】：

約10 d后細(xì)胞開始融合成片，需要傳代。前5-6代細(xì)胞大小形態(tài)均一，，之后出現(xiàn)逐漸增多的巨形細(xì)胞，胞漿內(nèi)顆粒也隨之增多，第10代細(xì)胞仍保持良好形態(tài)與增殖能力，之后未再繼續(xù)傳代。見圖1。2．生長(zhǎng)曲線：以1×104/ml接種于10ml培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞群體倍增時(shí)間（DT）為(47.4± 2.8) h (n=3)。

多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞表現(xiàn)為CK14陽(yáng)性染色
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R571;R735.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2649193