【摘要】：背景:結(jié)腸上皮細(xì)胞屏障受損是潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative Colitis,UC)發(fā)病的重要環(huán)節(jié),緊密連接(tight junction,TJ)是構(gòu)成結(jié)腸上皮的重要結(jié)構(gòu),其中緊密連接蛋白Claudin7作用顯著。有文獻(xiàn)報(bào)道,緊密連接蛋白異常磷酸化會(huì)改變Claudin之間的連接方式,導(dǎo)致上皮細(xì)胞間通透性發(fā)生改變,是影響上皮細(xì)胞屏障的重要因素。TRPV4是瞬時(shí)受體電位超家族(transient receptor potential vanilloid,TRPV)中重要成員之一,TRPV4被激活后可引起細(xì)胞內(nèi)TRPV4通道的開放導(dǎo)致胞漿內(nèi)Ca2+濃度明顯升高,激活鈣調(diào)激酶,影響Claudin的絲氨酸磷酸化。目的:探討Claudin7絲氨酸磷酸化對(duì)結(jié)腸上皮屏障功能的影響;闡明TRPV4通道對(duì)Claudin7絲氨酸磷酸化修飾的調(diào)節(jié)作用。方法:收取人的結(jié)腸癌癌旁組織、潰瘍性結(jié)腸炎結(jié)腸組織和結(jié)腸上皮細(xì)胞的蛋白,用蛋白免疫印跡方法檢測(cè)TRPV4的表達(dá);用免疫共沉淀的方法檢測(cè)TRPV4和Claudin-7之間的相互作用;利用PCR技術(shù)獲得Claudin-7絲氨酸磷酸化突變體,分子重組技術(shù)獲得重組載體,通過嘌呤霉素篩選建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,將各組細(xì)胞命名為Vector,Cld7-wild,Cld7-m S204,Cld7-m S206,Cld7-m S207;利用共聚焦顯微鏡觀察穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞熒光表達(dá),確定Claudin-7蛋白的定位;利用電阻儀檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞單層在使用TRPV4激動(dòng)劑或阻斷劑后各組細(xì)胞的跨膜阻抗;利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞在TRPV4激動(dòng)劑或阻斷劑刺激后的遷移能力。結(jié)果:(1)組織中,潰瘍性結(jié)腸炎患者結(jié)腸粘膜組織與正常組相比TRPV4表達(dá)升高。細(xì)胞中,Cld7-m S204組與Vector組相比TRPV4表達(dá)降低,Cld7-m S204組、Cld7-m S207組與Cld7-m S206組相比TRPV4的表達(dá)降低;(2)與Vector組相比,Cld7-m S204組細(xì)胞單層對(duì)FD20的通透性降低,Cld7-m S206和Cld7-m S207組的通透性升高。TRPV4激動(dòng)劑刺激后,Vector、Cld7-wild、Cld7-m S206和Cld7-m S207組單層細(xì)胞對(duì)FD20的通透性明顯升高,而預(yù)孵育TRPV4阻斷劑10min后加入TRPV4激動(dòng)劑,各組細(xì)胞單層對(duì)FD20的通透性與僅有激動(dòng)劑刺激相比降低。Cld7-m S204組細(xì)胞單層在兩種藥物處理下對(duì)FD20的通透性沒有區(qū)別;(3)與Vector、Cld7-wild和Cld7-m S206組相比,Cld7-m S204和Cld7-m S207組細(xì)胞單層的跨膜阻抗升高。Vector、Cld7-wild和Cld7-m S206組細(xì)胞單層的跨膜阻抗在使用阻斷劑預(yù)10min后再加入激動(dòng)劑與僅有激動(dòng)劑刺激相比有所升高。兩種藥物處理方式對(duì)Cld7-m S204和Cld7-m S207組細(xì)胞單層跨膜阻抗的影響沒有明顯差異;(4)Vector、Cld7-wild和Cld7-m S206組單層細(xì)胞在TRPV4激動(dòng)劑和阻斷劑的共同干預(yù)下,其遷移速率與僅有激動(dòng)劑刺激相比都明顯降低。兩種藥物處理方式對(duì)Cld7-m S204和Cld7-m S207組單層細(xì)胞的遷移率的影響無(wú)明顯差異。結(jié)論:在人結(jié)腸上皮細(xì)胞中,Claudin-7的204位點(diǎn)絲氨酸磷酸化增加上皮屏障的通透性;在人結(jié)腸上皮細(xì)胞中,TRPV4蛋白通過對(duì)Claudin-7的204和207位點(diǎn)絲氨酸磷酸化的調(diào)節(jié)改變Claudin-7的絲氨酸磷酸化水平,影響上皮屏障通透性以及細(xì)胞的遷移。
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R574.62

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本文編號(hào)：2648943