【摘要】：背景:結腸上皮細胞屏障受損是潰瘍性結腸炎(Ulcerative Colitis,UC)發(fā)病的重要環(huán)節(jié),緊密連接(tight junction,TJ)是構成結腸上皮的重要結構,其中緊密連接蛋白Claudin7作用顯著。有文獻報道,緊密連接蛋白異常磷酸化會改變Claudin之間的連接方式,導致上皮細胞間通透性發(fā)生改變,是影響上皮細胞屏障的重要因素。TRPV4是瞬時受體電位超家族(transient receptor potential vanilloid,TRPV)中重要成員之一,TRPV4被激活后可引起細胞內TRPV4通道的開放導致胞漿內Ca2+濃度明顯升高,激活鈣調激酶,影響Claudin的絲氨酸磷酸化。目的:探討Claudin7絲氨酸磷酸化對結腸上皮屏障功能的影響;闡明TRPV4通道對Claudin7絲氨酸磷酸化修飾的調節(jié)作用。方法:收取人的結腸癌癌旁組織、潰瘍性結腸炎結腸組織和結腸上皮細胞的蛋白,用蛋白免疫印跡方法檢測TRPV4的表達;用免疫共沉淀的方法檢測TRPV4和Claudin-7之間的相互作用;利用PCR技術獲得Claudin-7絲氨酸磷酸化突變體,分子重組技術獲得重組載體,通過嘌呤霉素篩選建立穩(wěn)轉細胞株,將各組細胞命名為Vector,Cld7-wild,Cld7-m S204,Cld7-m S206,Cld7-m S207;利用共聚焦顯微鏡觀察穩(wěn)轉細胞熒光表達,確定Claudin-7蛋白的定位;利用電阻儀檢測穩(wěn)轉細胞單層在使用TRPV4激動劑或阻斷劑后各組細胞的跨膜阻抗;利用細胞劃痕實驗檢測各組細胞在TRPV4激動劑或阻斷劑刺激后的遷移能力。結果:(1)組織中,潰瘍性結腸炎患者結腸粘膜組織與正常組相比TRPV4表達升高。細胞中,Cld7-m S204組與Vector組相比TRPV4表達降低,Cld7-m S204組、Cld7-m S207組與Cld7-m S206組相比TRPV4的表達降低;(2)與Vector組相比,Cld7-m S204組細胞單層對FD20的通透性降低,Cld7-m S206和Cld7-m S207組的通透性升高。TRPV4激動劑刺激后,Vector、Cld7-wild、Cld7-m S206和Cld7-m S207組單層細胞對FD20的通透性明顯升高,而預孵育TRPV4阻斷劑10min后加入TRPV4激動劑,各組細胞單層對FD20的通透性與僅有激動劑刺激相比降低。Cld7-m S204組細胞單層在兩種藥物處理下對FD20的通透性沒有區(qū)別;(3)與Vector、Cld7-wild和Cld7-m S206組相比,Cld7-m S204和Cld7-m S207組細胞單層的跨膜阻抗升高。Vector、Cld7-wild和Cld7-m S206組細胞單層的跨膜阻抗在使用阻斷劑預10min后再加入激動劑與僅有激動劑刺激相比有所升高。兩種藥物處理方式對Cld7-m S204和Cld7-m S207組細胞單層跨膜阻抗的影響沒有明顯差異;(4)Vector、Cld7-wild和Cld7-m S206組單層細胞在TRPV4激動劑和阻斷劑的共同干預下,其遷移速率與僅有激動劑刺激相比都明顯降低。兩種藥物處理方式對Cld7-m S204和Cld7-m S207組單層細胞的遷移率的影響無明顯差異。結論:在人結腸上皮細胞中,Claudin-7的204位點絲氨酸磷酸化增加上皮屏障的通透性;在人結腸上皮細胞中,TRPV4蛋白通過對Claudin-7的204和207位點絲氨酸磷酸化的調節(jié)改變Claudin-7的絲氨酸磷酸化水平,影響上皮屏障通透性以及細胞的遷移。
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R574.62

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本文編號：2648943