【摘要】：目的：潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis,UC)屬于炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD),其發(fā)病機制仍未完全闡明。細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-10(cytokine interleukin-10,IL-10)作為一種負(fù)性炎癥調(diào)控的細(xì)胞因子,可以下調(diào)UC腸道的炎癥級聯(lián)放大反應(yīng),是UC的一種有效的干預(yù)治療措施。然而,商業(yè)合成的重組人白細(xì)胞介素-10(human interleukin-10,hIL-10)有合成工藝復(fù)雜、價格昂貴、用藥途徑不方便等缺點,大大限制臨床應(yīng)用。雙歧桿菌可以改善UC患者的腸道菌群,其治療UC效果明確、價格低廉,已廣泛應(yīng)用于臨床。因此,本實驗用以往已構(gòu)建好的、并驗證過能在雙歧桿菌內(nèi)穩(wěn)定、高效、分泌性表達(dá)的大腸桿菌-雙歧桿菌穿梭質(zhì)粒載體(pBBAD-Xs),將hIL-10基因克隆入該表達(dá)載體,篩選并鑒定攜帶hIL-10的分泌型轉(zhuǎn)基因雙歧桿菌(transforming a hIL-10-containing plasmid into B. Longum,BL-hIL-10),通過體內(nèi)和體外試驗,驗證所分泌的hlL-10蛋白是否具有生物學(xué)活性和治療功能,由此進(jìn)一步探索BL-hIL-10冶療潰瘍性結(jié)腸炎的相關(guān)機制。方法：(1)選擇以往試驗已構(gòu)建好的質(zhì)粒載體pBADs-GFP與生物合成的含有hIL-10質(zhì)粒,通過雙酶切、酶連反應(yīng)構(gòu)建并鑒定pBADs-hIL-10穿梭質(zhì)粒,將pBADs/hIL-10質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入長雙歧桿菌(NCC 2705),合成BL-hIL-10,篩選出陽性克隆菌株,用RT-PCR法驗證質(zhì)粒hIL-10的基因表達(dá)后,以0.2%L-阿拉伯糖(L-arabinose,L-Arb)誘導(dǎo)表達(dá)12h、24h、48h后,分別用ELISA和Western blot法驗證轉(zhuǎn)基因雙歧桿菌中hIL-10蛋白表達(dá)水平,并選擇最佳的誘導(dǎo)表達(dá)時間。(2)在懸浮培養(yǎng)的THP-1中加入含有hIL-10蛋白的菌液培養(yǎng)上清,用CCK法檢測細(xì)胞毒性試驗。(3)hIL-10蛋白的體外生物學(xué)活性試驗：將菌液培養(yǎng)上清與1μg/mL脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)共同培養(yǎng)THP-1 8h后,用ELISA法測定培養(yǎng)液中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-a)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的變化情況。(4)hIL-10蛋白的體內(nèi)治療功能性試驗：用5%葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS)誘導(dǎo)UC小鼠模型后,給予UC小鼠模型口服0.2%L-Arb誘導(dǎo)表達(dá)后的BL-hIL-10連續(xù)治療7天。①UC小鼠模型全身和腸道炎癥反應(yīng)情況評估：檢測UC小鼠模型疾病活動指數(shù)(disease activity index,DAI)／C結(jié)腸長度測定、病理組織學(xué)評分,化學(xué)比色法檢測髓過氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)的活性;②NF-KB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路評定：ELISA去檢測小鼠外周血TNF-α、IL-6表達(dá)水平；分別用改良的ELISA法和Western blot法測定腸道NF-KB(p65)DNA結(jié)合活性及蛋白表達(dá)水平；分別用qRT-PCR法(?)口ELISA法測定腸道組織內(nèi)TNF-α、IL-6、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)的mRNA基因表達(dá)水平與蛋白水平；③UC小鼠模型CD4~+CD25~+Foxp~(3+)調(diào)節(jié)T細(xì)胞(CD4~+CD25~+Foxp~(3+) Treg)的表達(dá)測定：用流式細(xì)胞術(shù)測定小鼠外周血和腸系膜淋巴結(jié)內(nèi)CD4~+CD25~+Foxp~(3+)Treg與CD4~+CD25~+細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。結(jié)果：(1)在長雙歧桿菌NCC 2705中,成功的構(gòu)建了能分泌hIL-10蛋白的(?)BL-hIL-10傳遞體：其最佳誘導(dǎo)的表達(dá)時間是24h。(2)含有hlL-10的轉(zhuǎn)基因雙歧桿菌培養(yǎng)上清對懸浮培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞無細(xì)胞毒性。(3)培養(yǎng)上清能抑制LPS刺激的THP-1所分泌的TNF-α、IL-6的表達(dá)水平。(4)BL-hIL-10、B.Longum(BL)和轉(zhuǎn)pBADs-0雙歧桿菌(transforming a pBADs-0 plasmid into B.Longum,BL0)通過降低小鼠DAI、改善病理組織炎癥表現(xiàn)、抑制MPO活性;BL-hIL-10可以抑制UC小鼠腸道內(nèi)被激活的NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；BL-hIL-10可以上調(diào)UC小鼠外周血及腸系膜淋巴結(jié)的CD4~+CD25~+Foxp~(3+) Treg的表達(dá)水平。(5)BL-hIL-1治療組的治療效果明顯優(yōu)于BL和BZO治療組。 結(jié)論：在長雙歧桿菌(NCC 2705)內(nèi)成功構(gòu)建了一種新的、有效的IL-10的傳遞系統(tǒng),通過體內(nèi)、體外試驗,證實了BL-hIL-10所分泌的hlL-10蛋白具有IL-10細(xì)胞因子的生物學(xué)活性和治療功能性。通過對相關(guān)機制的探索發(fā)現(xiàn),BL-hIL-1O抑制了UC小鼠模型腸道內(nèi)被激活的NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和上調(diào)外周血及腸系膜淋巴結(jié)的CD4~+CD25~+Foxp~(3+)Treg的表達(dá)水平,在一定程度上,控制了UC小鼠模型全身及腸道的炎癥反應(yīng)。因此,BL-hIL-10具備了雙歧桿菌和IL-10雙重優(yōu)勢,且無明顯毒副作用、生產(chǎn)工藝簡單、治療方法簡便、治療效果顯著。BL-hIL-10有望成為擁有IL-10治療作用的,并能夠調(diào)節(jié)UC腸道微生態(tài)的新一代益生菌。
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R574.62

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8 王t，

本文編號：2647045