【摘要】：目的：潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis,UC)屬于炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD),其發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-10(cytokine interleukin-10,IL-10)作為一種負(fù)性炎癥調(diào)控的細(xì)胞因子,可以下調(diào)UC腸道的炎癥級(jí)聯(lián)放大反應(yīng),是UC的一種有效的干預(yù)治療措施。然而,商業(yè)合成的重組人白細(xì)胞介素-10(human interleukin-10,hIL-10)有合成工藝復(fù)雜、價(jià)格昂貴、用藥途徑不方便等缺點(diǎn),大大限制臨床應(yīng)用。雙歧桿菌可以改善UC患者的腸道菌群,其治療UC效果明確、價(jià)格低廉,已廣泛應(yīng)用于臨床。因此,本實(shí)驗(yàn)用以往已構(gòu)建好的、并驗(yàn)證過(guò)能在雙歧桿菌內(nèi)穩(wěn)定、高效、分泌性表達(dá)的大腸桿菌-雙歧桿菌穿梭質(zhì)粒載體(pBBAD-Xs),將hIL-10基因克隆入該表達(dá)載體,篩選并鑒定攜帶hIL-10的分泌型轉(zhuǎn)基因雙歧桿菌(transforming a hIL-10-containing plasmid into B. Longum,BL-hIL-10),通過(guò)體內(nèi)和體外試驗(yàn),驗(yàn)證所分泌的hlL-10蛋白是否具有生物學(xué)活性和治療功能,由此進(jìn)一步探索BL-hIL-10冶療潰瘍性結(jié)腸炎的相關(guān)機(jī)制。方法：(1)選擇以往試驗(yàn)已構(gòu)建好的質(zhì)粒載體pBADs-GFP與生物合成的含有hIL-10質(zhì)粒,通過(guò)雙酶切、酶連反應(yīng)構(gòu)建并鑒定pBADs-hIL-10穿梭質(zhì)粒,將pBADs/hIL-10質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入長(zhǎng)雙歧桿菌(NCC 2705),合成BL-hIL-10,篩選出陽(yáng)性克隆菌株,用RT-PCR法驗(yàn)證質(zhì)粒hIL-10的基因表達(dá)后,以0.2%L-阿拉伯糖(L-arabinose,L-Arb)誘導(dǎo)表達(dá)12h、24h、48h后,分別用ELISA和Western blot法驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因雙歧桿菌中hIL-10蛋白表達(dá)水平,并選擇最佳的誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間。(2)在懸浮培養(yǎng)的THP-1中加入含有hIL-10蛋白的菌液培養(yǎng)上清,用CCK法檢測(cè)細(xì)胞毒性試驗(yàn)。(3)hIL-10蛋白的體外生物學(xué)活性試驗(yàn)：將菌液培養(yǎng)上清與1μg/mL脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)共同培養(yǎng)THP-1 8h后,用ELISA法測(cè)定培養(yǎng)液中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-a)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)的變化情況。(4)hIL-10蛋白的體內(nèi)治療功能性試驗(yàn)：用5%葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS)誘導(dǎo)UC小鼠模型后,給予UC小鼠模型口服0.2%L-Arb誘導(dǎo)表達(dá)后的BL-hIL-10連續(xù)治療7天。①UC小鼠模型全身和腸道炎癥反應(yīng)情況評(píng)估：檢測(cè)UC小鼠模型疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index,DAI)／C結(jié)腸長(zhǎng)度測(cè)定、病理組織學(xué)評(píng)分,化學(xué)比色法檢測(cè)髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)的活性;②NF-KB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路評(píng)定：ELISA去檢測(cè)小鼠外周血TNF-α、IL-6表達(dá)水平；分別用改良的ELISA法和Western blot法測(cè)定腸道NF-KB(p65)DNA結(jié)合活性及蛋白表達(dá)水平；分別用qRT-PCR法(?)口ELISA法測(cè)定腸道組織內(nèi)TNF-α、IL-6、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)的mRNA基因表達(dá)水平與蛋白水平；③UC小鼠模型CD4~+CD25~+Foxp~(3+)調(diào)節(jié)T細(xì)胞(CD4~+CD25~+Foxp~(3+) Treg)的表達(dá)測(cè)定：用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定小鼠外周血和腸系膜淋巴結(jié)內(nèi)CD4~+CD25~+Foxp~(3+)Treg與CD4~+CD25~+細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。結(jié)果：(1)在長(zhǎng)雙歧桿菌NCC 2705中,成功的構(gòu)建了能分泌hIL-10蛋白的(?)BL-hIL-10傳遞體：其最佳誘導(dǎo)的表達(dá)時(shí)間是24h。(2)含有hlL-10的轉(zhuǎn)基因雙歧桿菌培養(yǎng)上清對(duì)懸浮培養(yǎng)的THP-1細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒性。(3)培養(yǎng)上清能抑制LPS刺激的THP-1所分泌的TNF-α、IL-6的表達(dá)水平。(4)BL-hIL-10、B.Longum(BL)和轉(zhuǎn)pBADs-0雙歧桿菌(transforming a pBADs-0 plasmid into B.Longum,BL0)通過(guò)降低小鼠DAI、改善病理組織炎癥表現(xiàn)、抑制MPO活性;BL-hIL-10可以抑制UC小鼠腸道內(nèi)被激活的NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；BL-hIL-10可以上調(diào)UC小鼠外周血及腸系膜淋巴結(jié)的CD4~+CD25~+Foxp~(3+) Treg的表達(dá)水平。(5)BL-hIL-1治療組的治療效果明顯優(yōu)于BL和BZO治療組。 結(jié)論：在長(zhǎng)雙歧桿菌(NCC 2705)內(nèi)成功構(gòu)建了一種新的、有效的IL-10的傳遞系統(tǒng),通過(guò)體內(nèi)、體外試驗(yàn),證實(shí)了BL-hIL-10所分泌的hlL-10蛋白具有IL-10細(xì)胞因子的生物學(xué)活性和治療功能性。通過(guò)對(duì)相關(guān)機(jī)制的探索發(fā)現(xiàn),BL-hIL-1O抑制了UC小鼠模型腸道內(nèi)被激活的NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和上調(diào)外周血及腸系膜淋巴結(jié)的CD4~+CD25~+Foxp~(3+)Treg的表達(dá)水平,在一定程度上,控制了UC小鼠模型全身及腸道的炎癥反應(yīng)。因此,BL-hIL-10具備了雙歧桿菌和IL-10雙重優(yōu)勢(shì),且無(wú)明顯毒副作用、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、治療方法簡(jiǎn)便、治療效果顯著。BL-hIL-10有望成為擁有IL-10治療作用的,并能夠調(diào)節(jié)UC腸道微生態(tài)的新一代益生菌。
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R574.62

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 盧青;;雙歧桿菌三聯(lián)活菌散聯(lián)合光療、丙種球蛋白治療ABO溶血病療效觀察[J];齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);2011年08期

2 孫麗麗;王超群;;雙歧桿菌的分離與鑒定[J];農(nóng)產(chǎn)品加工(學(xué)刊);2011年07期

3 徐文生;張艷艷;黃漫青;陳湘寧;;雙歧桿菌在不同材料上形成生物膜的研究[J];中國(guó)食品學(xué)報(bào);2011年03期

4 吳正祥;丁潔;楊九華;吳強(qiáng);楊楓;;雙歧桿菌對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎中趨化因子的影響[J];胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志;2011年06期

5 蔡芷荷;宋曼丹;周藹怡;陳秋霞;嚴(yán)紀(jì)文;朱海明;帥惠萍;蘇麗春;何天文;;莫匹羅星鋰鹽改良MRS檢測(cè)雙歧桿菌的應(yīng)用研究[J];中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志;2011年06期

6 楊志梅;張滿才;石紅;張建英;張麗花;;媽咪愛(ài)治療母乳性黃疸療效觀察[J];基層醫(yī)學(xué)論壇;2011年28期

7 李曉芳;;腸閉鎖患兒術(shù)后腸道益生菌的定植研究[J];實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志;2011年12期

8 楊俊娜;;喜炎平與雙歧桿菌聯(lián)合治療小兒病毒腹瀉的臨床觀察[J];當(dāng)代醫(yī)學(xué);2011年25期

9 史訓(xùn)統(tǒng);王有成;胡國(guó)華;;茵梔黃聯(lián)合雙歧桿菌三聯(lián)活菌膠囊治療母乳性黃疸效果觀察[J];中國(guó)鄉(xiāng)村醫(yī)藥;2011年09期

10 張雪松;;喜炎平聯(lián)合雙歧桿菌治療小兒病毒腹瀉的臨床研究[J];現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué);2011年16期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 程茜;聶晶;;雙歧桿菌及其WPG對(duì)臍血來(lái)源DC分化成熟的影響[A];第六屆全國(guó)兒科微生態(tài)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨兒科微生態(tài)學(xué)新進(jìn)展學(xué)習(xí)班資料匯編[C];2008年

2 熊菲;程茜;;雙歧桿菌對(duì)單核細(xì)胞來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞的影響[A];中國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)會(huì)第九次全國(guó)營(yíng)養(yǎng)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2004年

3 黃鴻眉;程茜;;雙歧桿菌對(duì)輪狀病毒感染腸上皮細(xì)胞IL-8、TNF-α分泌的影響[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十四次全國(guó)兒科學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

4 劉麗達(dá);倪學(xué)勤;曾東;;雙歧桿菌植酸酶的研究進(jìn)展[A];第四屆第九次全國(guó)學(xué)術(shù)研討會(huì)暨飼料和動(dòng)物源食品安全戰(zhàn)略論壇論文集（上冊(cè)）[C];2008年

5 管曉冉;張德純;李金玲;席青;;雙歧桿菌發(fā)酵果蔬汁對(duì)小鼠免疫功能的影響[A];重慶市預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)2010年論文集[C];2011年

6 程茜;黃鴻眉;;雙歧桿菌抑制輪狀病毒感染腸上皮細(xì)胞IL-8、TNF-α分泌的研究[A];第六屆全國(guó)兒科微生態(tài)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議暨兒科微生態(tài)學(xué)新進(jìn)展學(xué)習(xí)班資料匯編[C];2008年

7 龐小燕;趙立平;;基于屬特異性PCR基礎(chǔ)上的TGGE和克隆文庫(kù)方法分析人糞便中雙歧桿菌的組成[A];中國(guó)畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)動(dòng)物微生態(tài)學(xué)分會(huì)第三屆第七次學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2004年

8 袁靜;王恒梁;黃留玉;;雙歧桿菌體內(nèi)體外的比較蛋白質(zhì)組和比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究[A];中國(guó)蛋白質(zhì)組學(xué)第三屆學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要[C];2005年

9 邵建寧;麻和平;彭章普;龔偉中;;雙歧桿菌直投式發(fā)酵劑制備研究[A];2006中國(guó)微生物學(xué)會(huì)第九次全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)暨學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2006年

10 徐杰;郭雅梅;張霞;李丹清;趙琳;張萍;關(guān)玉峰;蘇本利;;阿卡波糖對(duì)2型糖尿病腸道雙歧桿菌的作用[A];2008內(nèi)分泌代謝性疾病系列研討會(huì)暨中青年英文論壇論文匯編[C];2008年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 馬寧;日本發(fā)表報(bào)告稱雙歧桿菌能延年益壽[N];中國(guó)食品報(bào);2011年

2 上海市預(yù)防醫(yī)學(xué)會(huì)原養(yǎng)生保健專業(yè)委員會(huì)副主任委員 傅善來(lái);人類的“健康衛(wèi)士”——雙歧桿菌[N];家庭醫(yī)生報(bào);2004年

3 祝銘;如何提高體內(nèi)雙歧桿菌量[N];醫(yī)藥養(yǎng)生保健報(bào);2007年

4 國(guó)訊;雙歧桿菌乳桿菌三聯(lián)活菌片說(shuō)明書(shū)修訂[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2011年

5 廣州市微生物研究所 姚朔影 夏楓耿;展望雙歧桿菌的開(kāi)發(fā)前景[N];中國(guó)食品質(zhì)量報(bào);2004年

6 張丹;邵貞先：20年研究微生物雙歧桿菌實(shí)現(xiàn)重大突破[N];中國(guó)高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導(dǎo)報(bào);2008年

7 ;基因抗癌需要“運(yùn)載火箭”雙歧桿菌“上崗”堪當(dāng)重任[N];健康報(bào);2001年

8 王t，

本文編號(hào)：2647045