【摘要】：目的本研究旨在研究乙型肝炎病毒X蛋白(HBx)在致人體非腫瘤系肝細(xì)胞L02中的惡性轉(zhuǎn)化作用并初步探討Notch信號通路在此過程中的作用及機制。 方法通過載體將HBx全長基因轉(zhuǎn)入L02細(xì)胞構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)HBx的細(xì)胞株L02/HBx,觀測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的增殖,細(xì)胞周期及凋亡的變化。再將其接種細(xì)胞于BALB/c裸鼠頸背部皮下,觀測其成瘤效應(yīng)。進一步通過qRT-PCR和Western blotting檢測HBx對Notch信號通路重要分子Jagged1, Notch1, Notch1-IC及Hes1表達(dá)水平的影響。并應(yīng)用γ-分泌酶抑制劑DAPT阻斷Notch信號通路,通過檢測阻斷后Notch通路相關(guān)效應(yīng)分子mRNA及蛋白表達(dá)水平的變化來判斷阻斷效率,并觀測阻斷后細(xì)胞的增殖,細(xì)胞周期及凋亡的變化。 結(jié)果 (1)與對照組L02細(xì)胞相比,轉(zhuǎn)染HBx后的L02/HBx細(xì)胞增殖速度顯著加快,凋亡率及G0/G1期細(xì)胞比例明顯降低,S期細(xì)胞比例顯著增高。 (2)裸鼠成瘤實驗發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染HBx后的L02/HBx細(xì)胞腫瘤增長速度及腫瘤重量顯著高于對照組。 (3)qRT-PCR及Western blotting檢測表明, L02/HB x細(xì)胞的Notch1, Jagged1, Notch1-IC, Hes1在mRNA及蛋白表達(dá)水平上均顯著高于L02細(xì)胞。*國家自然科學(xué)基金(編號: 30971352) (4)應(yīng)用γ-分泌酶抑制劑DAPT阻斷Notch信號通路后,L02/HBx細(xì)胞的存活率呈時間-劑量依賴性降低,細(xì)胞周期呈時間-劑量依賴性抑制,凋亡呈時間-劑量依賴性增加,而阻斷Notch信號通路對正常的L02細(xì)胞生物學(xué)行為幾乎沒有影響。 結(jié)論我們的研究表明,(1)HBx可顯著促進人類非腫瘤肝細(xì)胞L02細(xì)胞株在體外和體內(nèi)的生長,即HBx可誘導(dǎo)L02細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化;(2)在這個過程中Notch信號通路的激活是不可缺少的:①在L02細(xì)胞中,HBx基因促進Notch信號通路主要分子Jagged-1,Notch-1,Notch1-IC,Hes-1在mRNA及蛋白水平上的表達(dá),即在L02細(xì)胞中,異位表達(dá)的HBx可激活Notch信號通路。結(jié)合第一部分的研究結(jié)果,初步表明Notch信號通路的激活與HBx刺激L02細(xì)胞的增殖并促進其轉(zhuǎn)化有關(guān);②通過γ-secretase抑制劑DAPT阻斷L02/HBx細(xì)胞的Notch信號通路后,HBx所介導(dǎo)的L02細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的生物學(xué)效應(yīng)亦被阻斷,且呈劑量-時間依賴性;③而DAPT阻斷正常L02細(xì)胞的Notch信號通路對其生物學(xué)效應(yīng)幾乎沒有影響。推測Notch信號通路在HBx致L02細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中起關(guān)鍵作用。
【圖文】：

關(guān)系更少有研究。鑒于此，本研究旨在觀測 HBx 在肝細(xì)胞 L02 中的惡性轉(zhuǎn)化作用并初步探討 Notch 信號通路在此過程中的作用及其機制。本研究中，我們首先通過測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 HBx 基因的 L02 細(xì)胞相對于正常 L02 細(xì)胞的細(xì)胞增殖，細(xì)胞周期，凋及裸鼠成瘤的變化，，研究 HBx 對 L02 細(xì)胞生物學(xué)行為的影響；然后應(yīng)用 qRT-PCRWestern blotting 的方法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞中 Notch 信號通路的表達(dá)；最后用 γ-secretase 抑制劑（該抑制劑通過抑制 γ-secretase 的活性從而抑制 Notch 的活性段 NICD 的生成，達(dá)到抑制 Notch 信號通路的目的，見圖 1）來阻斷轉(zhuǎn)染細(xì)胞及未轉(zhuǎn)細(xì)胞的 Notch 信號通路，通過研究細(xì)胞生物學(xué)行為如細(xì)胞增殖，細(xì)胞周期及凋亡的化，來探討 HBx 和 Notch 信號通路在 L02 細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用及相互關(guān)系。

烤箱，68 度，30min；樹脂封片。分析SPSS17.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以 mean±SD 表多個樣本間的比較采用方差分析或重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方。 L02 細(xì)胞增殖的影響件下連續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞 24~96h，CCK-8 法檢測各組細(xì)胞果顯示 L02/HBx 組細(xì)胞增值速度快于對照組 L02/pc 開始出現(xiàn)出現(xiàn)顯著差異（p＜0.05），72h、96h 差異3.1 組和 L02 組間無統(tǒng)計學(xué)差異(圖 1)。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R512.62

【參考文獻】

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1 葉秀珍,朱德厚,沈鼎武;體外連續(xù)培養(yǎng)的成人肝細(xì)胞的超顯微結(jié)構(gòu)[J];實驗生物學(xué)報;1980年04期

本文編號：2646322