【摘要】：第一部分：I型干擾素受體和IL-17及其受體在慢性乙型病毒性肝炎患者中的變化 研究背景：干擾素-alpha (Interferon-alpha IFN-α)是治療慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B CHB)患者的一線抗病毒藥物,I型干擾素受體(type I interferon-α/βreceptor, IFNAR)在干擾素α的起效作用過(guò)程中至關(guān)重要,我們已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)輔助性T17細(xì)胞(T helper 17 cells Th17)可能參與CHB的發(fā)病機(jī)制。然而慢性乙型病毒性肝炎患者體內(nèi)IFNAR的變化以及其在干擾素α2b治療療效評(píng)價(jià)中的作用尚不清楚,而且IFNAR與Th17分泌的白介素17(interleukin-17 IL-17)之間的關(guān)系有待于進(jìn)一步研究。 研究目的：本研究檢測(cè)了慢性乙肝患者體內(nèi)外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells PBMCs)以及肝組織內(nèi)IFNAR以及IL-17及其受體的變化以揭示IFNAR其在應(yīng)用干擾素α2b治療療效預(yù)測(cè)中的作用,同時(shí)探討慢性乙型病毒性肝炎患者IFNAR與IL-17的關(guān)系。 研究方法：共入選84例慢性乙型病毒性肝炎患者以及10例健康志愿者,其中25例接受了肝穿刺活檢術(shù)。84例慢性乙肝患者中有25例符合抗病毒治療的患者接受至少3個(gè)月的干擾素α2b治療。 分離PBMCs,淋巴細(xì)胞以及單核細(xì)胞內(nèi)IFN-α/βR-1和IFN-α/βR-2的表達(dá)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)定,提取PBMCs中的RNA, IFNAR1, IFNAR2, IL-6, IL-8,IL-17A, IL-17F, IL-17RA, IL-17RC, TGF-β1和TNF-α的mRNA水平用SYBR Green RT-PCR進(jìn)行監(jiān)測(cè)。 肝組織中IFNAR-1和IFNAR-2用免疫熒光以及免疫組化染色進(jìn)行觀察。提取肝組織RNA,RT-PCR檢測(cè)肝組織內(nèi)IFNAR1,IFNAR2,IL-6,IL-8,IL-17A,IL-17F, IL-17RA, IL-17RC, TGF-β1和TNF-α的mRNA水平。 在應(yīng)用干擾素a2b治療的患者中,每一個(gè)月監(jiān)測(cè)外周血淋巴細(xì)胞以及單核細(xì)胞內(nèi)IFN-α/βR-1和IFN-α/βR-2的表達(dá)以及外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)IFNAR1, IFNAR2, IL-17A, IL-17F, IL-17RA和IL-17RC的mRNA變化。 研究結(jié)果：慢性乙肝患者外周血單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中IFN-α/βR-1和IFN-α/βR-2的表達(dá)升高,肝組織內(nèi)IFNAR-1和IFNAR-2的水平也明顯升高,并與與肝組織HBV-DNA正相關(guān)。在應(yīng)用干擾素α2b治療的慢性乙肝患者中,單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞內(nèi)IFN-α/βR-1和IFN-α/βR-2的表達(dá)在第一個(gè)月明顯升高,而在隨后的兩個(gè)月治療中逐步降低。在治療應(yīng)答組(12/25)單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中IFN-α/βR-1和IFN-α/βR-2的表達(dá)明顯高于非應(yīng)答組(13/25)。治療前單核細(xì)胞內(nèi)IFNα/βR-2表達(dá)較高的患者其干擾素應(yīng)答率明顯高于較低的患者。另外慢性乙型病毒性肝炎患者肝組織和PBMC中IFNAR,IL-17A, IL-17F,IL-17RA,IL-17RC,IL-6,IL-8,TGF-β1和TNF-α的表達(dá)明顯升高,IL-17及其受體的表達(dá)與血清轉(zhuǎn)氨酶的水平呈正相關(guān),并且與炎癥細(xì)胞因子IL-6,IL-8, TGF-β1和TNF-α的水平呈正相關(guān)。PBMCs中IFN-α/βR1和IFN-α/βR2的表達(dá)與IL-17及其受體呈負(fù)相關(guān),并且隨著干擾素的應(yīng)用,IL-17及其受體的水平明顯降低。 結(jié)論：慢性乙型病毒性肝炎外周血單個(gè)核細(xì)胞以及肝組織內(nèi)IFN-α/βR-1和IFN-α/βR-2的表達(dá)升高。在干擾素治療有效組,其外周淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞IFNAR的表達(dá)均高于無(wú)效組,提示IFNAR在外周血單個(gè)核細(xì)胞的表達(dá)影響干擾素的療效；干擾素治療前,外周血單核細(xì)胞表面IFNAR-2的表達(dá)可以作為預(yù)測(cè)干擾素治療慢性乙型病毒性肝炎療效的預(yù)測(cè)指標(biāo)。 第二部分：IL-17及其信號(hào)系統(tǒng)參與肝纖維化的形成 研究背景：研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生IL-17的Thl7細(xì)胞與慢性炎癥反應(yīng)以及自身免疫性疾病廣泛相關(guān)。而且我們發(fā)現(xiàn)慢性乙型病毒性肝炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞以及肝組織內(nèi)IL-17及其受體的水平明顯升高。提示Th17可能參與慢性肝病的發(fā)病機(jī)制。近來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)IL-17可以導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化,為我們進(jìn)一步探討IL-17在肝纖維化發(fā)病中的作用提供了依據(jù)。 研究目標(biāo)：確定IL-17在肝纖維化發(fā)病機(jī)制中的作用,包括IL-17對(duì)肝臟枯否氏細(xì)胞以及肝星狀細(xì)胞的激活作用,以及其在肝臟原代細(xì)胞中的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。 研究方法：應(yīng)用IL-17A和IL-17F刺激人LX-2和hTERT (human telomerase reverse transcriptase)星狀細(xì)胞株,分析IL-17對(duì)星狀細(xì)胞株的激活作用以及其在星狀細(xì)胞株中的信號(hào)傳導(dǎo)。星狀細(xì)胞α-SMA, collagenα1(Ⅰ), TGF-β1和TIMP1mRNA的表達(dá)用RT-PCR方法檢測(cè),IL-17誘導(dǎo)的ERK1/2(extracellular regulated proteinkinases ERK), AKT (serine Threonine Kinase)和NF-κB (nuclear factorκB)的磷酸化用Western blot方法檢測(cè),NF-κB在星狀細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞核內(nèi)移位用細(xì)胞免疫熒光染色觀察。 分離原代肝臟枯否氏細(xì)胞、星狀細(xì)胞和肝細(xì)胞,分別應(yīng)用IL-17A, IL-17F以及IL-17A+IL-17F進(jìn)行刺激,IL-17對(duì)肝臟原代肝臟枯否氏細(xì)胞、星狀細(xì)胞和肝細(xì)胞的作用用RT-PCR, Western blot以及細(xì)胞免疫熒光的方法進(jìn)行檢測(cè),IL-17A依賴的膠原蛋白激活的機(jī)制進(jìn)一步由體外實(shí)驗(yàn)野生型以及IL-17R敲除型collagen-GFP小鼠原代星狀細(xì)胞中加以證實(shí)。 我們利用純合子STAT3 floxed等位基因(homozygous for STAT3 floxed allele STAT3f1/f1)小鼠與(膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白-cre Glial fibrillary acidic protein GFAP-cre)小鼠進(jìn)行雜交,獲得定靶于星狀細(xì)胞敲除STAT3的小鼠,分離小鼠的星狀細(xì)胞,應(yīng)用IL-17A進(jìn)行刺激,觀察星狀細(xì)胞的活化情況,應(yīng)用STAT3f1/f1小鼠作為對(duì)照。從而確定IL-17A對(duì)星狀細(xì)胞的激活是否依賴于STAT3的激活。 野生型(WT)以及IL-17RA敲除型小鼠用膽總管結(jié)扎(bile duct ligationBDL)和四氯化碳(carbon tetrachloride CCl4)腹腔內(nèi)注射誘導(dǎo)肝纖維化,通過(guò)天狼腥紅(Sirius Red)染色觀察肝組織病理,分離BDL模型組以及對(duì)照組肝臟內(nèi)實(shí)質(zhì)性細(xì)胞(non-parenchymal cells NPCs)。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)NPCs各細(xì)胞群中IL-17A的表達(dá)。α-SMA免疫組化染色評(píng)估肝纖維化的程度,提取肝組織RNA, RT-PCR評(píng)估肝組織內(nèi)MMP3,TIMP, TNF-α, TGF-β1, IL-6, IL-1-β的表達(dá)。提取肝組織蛋白質(zhì)Western-blot檢測(cè)肝組織蛋白中α-SMA的表達(dá)。 研究結(jié)果：IL-17A在體外實(shí)驗(yàn)中可以激活枯否氏細(xì)胞(表達(dá)IL-17A, IL-17F, TGF-β1, IL-6 and IL-1-β)以及肝臟星狀細(xì)胞(表達(dá)α-SMA, collagenα1 (I), TGF-β1, and TIMP1),表明IL-17A可以獨(dú)立激活枯否氏細(xì)胞以及產(chǎn)膠原細(xì)胞。IL-17A激活星狀細(xì)胞的信號(hào)通路包括STAT3, ERK1/2, AKT, NF-κB的磷酸化,其中STAT3的磷酸化是IL-17A激活星狀細(xì)胞的首要信號(hào)通路,定靶于星狀細(xì)胞敲除STAT3后,IL-17A激活星狀細(xì)胞的功能被明顯阻斷。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)清除IL-17A信號(hào)通路(在IL-17RA敲除型小鼠)與野生型相比可以明顯減輕BDL (65±7%)以及CCl4(45±8%)誘導(dǎo)產(chǎn)生的肝纖維化。BDL誘導(dǎo)的肝纖維化模型中IL-17A主要在炎癥細(xì)胞中明顯升高(CD4+, CD8+ T cellsKupffer cells)。IL-17A的作用與星狀細(xì)胞內(nèi)I型膠原蛋白的表達(dá)增高相關(guān), 結(jié)論：IL-17在肝纖維化的發(fā)病機(jī)制中有重要的作用,IL-17A可以明顯激活肝臟枯否氏細(xì)胞和星狀細(xì)胞,IL-17A激活星狀細(xì)胞主要依賴于STAT3的磷酸化。 第三部分：枯否氏細(xì)胞IL-17A/IL-17RA信號(hào)通路在Th17導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)病機(jī)制中至關(guān)重要 研究背景：枯否氏細(xì)胞被認(rèn)為是參與肝內(nèi)炎癥反應(yīng)的首要靶細(xì)胞。在肝臟受損傷后,枯否氏細(xì)胞可以激活并釋放一系列驗(yàn)證前細(xì)胞因子以及活性氧介質(zhì),可以激活星狀細(xì)胞,從而導(dǎo)致肝纖維化。我們研究發(fā)現(xiàn)IL-17可以激活枯否氏細(xì)胞和星狀細(xì)胞,敲除IL-17RA可以明顯減輕由BDL和CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化。同時(shí)發(fā)現(xiàn)IL-17在體外激活枯否氏細(xì)胞的作用明顯強(qiáng)于星狀細(xì)胞。為此我們應(yīng)用體外枯否氏細(xì)胞與星狀細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng),體內(nèi)進(jìn)行IL-17RA和WT小鼠之間的骨髓移植(bone marrow transplantation BMT),試圖揭示IL-17導(dǎo)致肝纖維化的機(jī)制。 研究目標(biāo)：確定IL-17導(dǎo)致肝纖維化的發(fā)病機(jī)制,探討枯否氏細(xì)胞和星狀細(xì)胞內(nèi)IL-17及其信號(hào)通路在肝纖維化發(fā)病機(jī)制中的地位。 研究方法：體外實(shí)驗(yàn)中我們分離WT和IL-17RA小鼠原代枯否氏細(xì)胞,同時(shí)分離WT-collage-GFP和IL-17R-/--collagen-GFP小鼠原代星狀細(xì)胞,聯(lián)合培養(yǎng)后應(yīng)用IL-17A進(jìn)行刺激24小時(shí),觀察星狀細(xì)胞表達(dá)膠原蛋白-GFP的陽(yáng)性率。 體內(nèi)試驗(yàn)我們采用了骨髓移植的實(shí)驗(yàn)方法,受體小鼠經(jīng)氯膦酸鹽脂質(zhì)體(Clodronate-Liposomes)靜脈注射清除單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)和放射性照射清除淋巴細(xì)胞之后完成IL-17A-/-,IL-17RA-/-與WT小鼠之間的骨髓移植,共獲得5組嵌合體小鼠,分別為：WT移植入WT組(枯否氏細(xì)胞為野生型,HSCs為野生型)；IL-17A-/-移植入WT組(枯否氏細(xì)胞無(wú)IL-17A; HSCs為野生型)；WT移植入IL-17RA-/-組(枯否氏細(xì)胞為野生型,HSCs無(wú)IL-17RA);IL-17RA-/-移植入WT組(枯否氏細(xì)胞無(wú)IL-17RA, HSCs為野生型)以及IL-17RA-/-移植入IL-17RA-/-組(枯否氏細(xì)胞和HSCs均無(wú)IL-17RA)。2個(gè)月后嵌合體小鼠行膽管結(jié)扎構(gòu)建肝纖維化模型,通過(guò)天狼腥紅染色(Sirius Red),α-SMA免疫組化染色以及RT-PCR評(píng)估肝纖維化。 研究結(jié)果：WT枯否氏細(xì)胞與IL-17RA-/--collagen-GFP星狀細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)組經(jīng)IL-17A刺激24小時(shí)后,其星狀細(xì)胞表達(dá)collagen-GFP的陽(yáng)性率明顯高于IL-17RA-/-枯否氏細(xì)胞與WT-collagen-GFP星狀細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)組(34±11%比25±7%)。而在骨髓移植實(shí)驗(yàn)中,清除骨髓來(lái)源的IL-17A/IL-17RA信號(hào)通路系統(tǒng)(IL-17RA-/-移植入WT或者IL-17A移植入WT)組,可以分別減輕肝纖維化55±9%和50±12%。但是清除肝臟內(nèi)生性細(xì)胞(肝細(xì)胞和星狀細(xì)胞)IL-17A/IL-17RA信號(hào)通路組(WT移植入IL-17RA-/-),其肝纖維化程度仍有所減輕,但不是很明顯(25±7%)。 結(jié)論：枯否氏細(xì)胞內(nèi)IL-17A/IL-17RA信號(hào)通路對(duì)于誘導(dǎo)肝纖維化至關(guān)重要
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R575.2

【引證文獻(xiàn)】

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1 劉嵐;傅睿;;嬰兒巨細(xì)胞病毒性肝炎患兒肝組織中IL-17的表達(dá)及意義[J];實(shí)用臨床醫(yī)學(xué);2012年04期

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本文編號(hào)：2644768