發(fā)布時(shí)間：2020-04-29 11:11

【摘要】：一、研究背景肝臟各種良惡性疾病常引起肝功能不同程度的損傷。特別在肝臟惡性腫瘤的手術(shù)治療中,肝功能衰竭是患者術(shù)后死亡的一大原因,也是制約晚期肝癌患者進(jìn)行手術(shù)治療的難點(diǎn)之一。目前對(duì)于肝功能衰竭的治療常用方法有非生物型人工肝支持治療及肝移植,但這些技術(shù)仍存在諸多局限性,不能很好地解決術(shù)后肝功能衰竭的問(wèn)題。而過(guò)去研究發(fā)現(xiàn)肝臟是一個(gè)具有強(qiáng)大的再生能力的器官,在部分肝切除術(shù)(partial hepatectomy,PH)后,肝臟能在較短期內(nèi)通過(guò)自身的修復(fù)完全恢復(fù)自身體積和功能~([1]),因此人為調(diào)控肝臟再生使得肝臟恢復(fù)原有功能可作為一種治療肝功能衰竭的有效手段。對(duì)于肝臟外科,若能有效調(diào)控肝臟再生,既可避免肝切除術(shù)后可能出現(xiàn)的肝功能衰竭問(wèn)題,又可拓寬肝切除術(shù)的適應(yīng)癥,為肝臟疾病的治療提供強(qiáng)有力的支持。因此,深入研究肝臟再生過(guò)程中肝細(xì)胞增殖機(jī)制及肝再生調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的作用是必不可少的。跨膜和泛素樣結(jié)構(gòu)域蛋白1(Tmub1),也被稱為肝細(xì)胞臨時(shí)穿梭蛋白(HOPS),是一個(gè)核質(zhì)穿梭蛋白,包含一個(gè)泛素樣結(jié)構(gòu)域、一個(gè)出核信號(hào)和脯氨酸富集區(qū)~([2])。在肝再生過(guò)程的不同時(shí)間,Tmub1蛋白大量表達(dá),并改變亞細(xì)胞定位,抑制肝細(xì)胞增殖~([3])。有文獻(xiàn)報(bào)道,在肝細(xì)胞增殖過(guò)程中,轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ可增強(qiáng)Tmub1的表達(dá)~([3]);Tmub1沉默后導(dǎo)致中心體功能異常,引起細(xì)胞分裂失敗和細(xì)胞周期阻滯~([4]),提示Tmub1可影響細(xì)胞周期進(jìn)程~([5])。Tmub1參加了肝再生調(diào)控網(wǎng)絡(luò),但Tmub1在肝再生調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起的作用及Tmub1對(duì)細(xì)胞增殖的影響機(jī)制尚未闡明。二、研究目的1.通過(guò)構(gòu)建小鼠70%肝切除模型,并向小鼠轉(zhuǎn)染異位表達(dá)Tmub1質(zhì)粒,在體內(nèi)層面明確Tmub1對(duì)肝再生和肝細(xì)胞增殖的影響。2.使用人正常肝細(xì)胞L02,明確Tmub1通過(guò)抑制STAT3磷酸化對(duì)肝細(xì)胞增殖的影響。3.探討Tmub1與STAT3的相互作用機(jī)制。三、材料和方法1.構(gòu)建小鼠70%肝切除再生模型,并分別于術(shù)前2天、術(shù)后1天通過(guò)尾靜脈向小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)染Tmub1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及陰性對(duì)照質(zhì)粒,并設(shè)立假手術(shù)組(不行肝切除術(shù),僅開(kāi)腹并游離肝周韌帶)。通過(guò)檢測(cè)術(shù)后3天小鼠肝重/體重、血清AST/ALT水平,評(píng)估各組小鼠肝切除術(shù)后肝再生情況,使用Western Blotting技術(shù)檢測(cè)增殖相關(guān)蛋白表達(dá)情況,并采用免疫組化和HE染色分析各組小鼠肝損傷情況和肝細(xì)胞增殖情況,明確Tmub1對(duì)小鼠肝再生的影響以及對(duì)STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響。2.使用人Tmub1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及shRNA,瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人正常肝細(xì)胞L02后通過(guò)EdU檢測(cè)Tmub1異位表達(dá)對(duì)L02細(xì)胞增殖能力的影響,WB檢測(cè)Tmub1異位表達(dá)對(duì)STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,免疫熒光和WB檢測(cè)Tmub1異位表達(dá)對(duì)STAT3和p-STAT3亞細(xì)胞定位的影響。3.通過(guò)相應(yīng)Rescue實(shí)驗(yàn),觀察STAT3抑制劑stattic/激動(dòng)劑OSM對(duì)Tmub1誘導(dǎo)的肝細(xì)胞增殖能力的逆轉(zhuǎn)作用。4.通過(guò)生物信息學(xué)分析、染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(ChIP)及熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)(Luciferase reporter gene assay)探討STAT3對(duì)Tmub1表達(dá)的誘導(dǎo)作用,通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)明確Tmub1與STAT3蛋白的相互作用。5.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析;計(jì)量資料結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間均數(shù)采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。P0.05作為顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的標(biāo)準(zhǔn)。四、結(jié)果1.在肝切除術(shù)后3天,過(guò)表達(dá)Tmub1的小鼠肝重/體重比顯著低于陰性對(duì)照組及空白組小鼠,提示過(guò)表達(dá)Tmub1延緩了小鼠肝臟再生;血清轉(zhuǎn)氨酶檢測(cè)提示過(guò)表達(dá)Tmub1組小鼠血清ALT、AST水平顯著高于對(duì)照組,提示肝功能恢復(fù)情況差;同時(shí),免疫組化及HE染色示Tmub1過(guò)表達(dá)組小鼠肝細(xì)胞損傷更為嚴(yán)重,且增殖指標(biāo)Ki-67、p-H3陽(yáng)性率顯著低于陰性對(duì)照組及空白組小鼠;進(jìn)一步的Western Blotting結(jié)果提示STAT3磷酸化水平及MCM2、Cyclin D1的表達(dá)量在過(guò)表達(dá)Tmub1小鼠中明顯降低,提示Tmub1顯著抑制了肝再生過(guò)程中的肝細(xì)胞增殖。2.Western Blotting提示過(guò)表達(dá)Tmub1顯著降低STAT3磷酸化水平及cyclin D1和c-myc的表達(dá)量而不影響STAT3總蛋白水平;反之干擾Tmub1表達(dá)后,STAT3磷酸化水平及cyclin D1和c-myc的表達(dá)量顯著增高,但總STAT3表達(dá)量不變。免疫熒光提示Tmub1不影響STAT3的亞細(xì)胞定位。3.EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)提示,過(guò)表達(dá)Tmub1的人正常肝細(xì)胞L02增殖受到顯著抑制,但在加入STAT3激動(dòng)劑OSM后細(xì)胞增殖情況恢復(fù);干擾Tmub1表達(dá)可顯著促進(jìn)L02細(xì)胞增殖,而該效應(yīng)可被STAT3抑制劑stattic所回復(fù)。Western Blotting結(jié)果同樣提示過(guò)表達(dá)Tmub1引起STAT3磷酸化水平及cyclin D1和c-myc的表達(dá)量降低,可在加入OSM之后恢復(fù)。反之亦然。4.生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)人的Tmub1基因啟動(dòng)子區(qū)域存在一個(gè)STAT3的結(jié)合位點(diǎn)。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(ChIP)及熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)(Luciferase reporter gene assay)提示STAT3可與Tmub1啟動(dòng)子相結(jié)合,并提高Tmub1啟動(dòng)子的活性、增強(qiáng)Tmub1的表達(dá)。5.利用免疫共沉淀技術(shù)(co-IP),我們發(fā)現(xiàn)Tmub1與STAT3可形成蛋白質(zhì)復(fù)合物。五、結(jié)論Tmub1是一個(gè)肝再生的負(fù)相調(diào)控因子。STAT3可誘導(dǎo)Tmub1的基因表達(dá),而Tmub1又可通過(guò)結(jié)合并抑制STAT3的磷酸化激活來(lái)發(fā)揮其對(duì)肝細(xì)胞增殖的抑制作用。Tmub1和STAT3可能形成了一個(gè)肝細(xì)胞增殖過(guò)程中的負(fù)反饋調(diào)控環(huán)路來(lái)調(diào)控肝再生的進(jìn)程。
【圖文】：

陸軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文18圖2.1 過(guò)表達(dá)Tmub1抑制小鼠肝切除術(shù)后肝臟再生。A：體內(nèi)轉(zhuǎn)染及肝部分切除術(shù)（PH）實(shí)驗(yàn)計(jì)劃示意圖；B: 在PH后3天后，Tmub1過(guò)表達(dá)組和陰性對(duì)照組小鼠肝體重比。以假手術(shù)組小鼠為對(duì)照；C：PH3天后，血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）及谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）水平。*：p < 0.05；**：p <0.01；***：p < 0.001。n=3。2.3.2 過(guò)表達(dá) Tmub1 抑制增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)我們將 PH 后 0 時(shí)及 3 天獲得的再生肝組織進(jìn)行 Western Blotting 檢測(cè)及組織學(xué)分析。與對(duì)照組相比，通過(guò)體內(nèi)轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá) Tmub1 質(zhì)粒，，成功使小鼠肝臟內(nèi) Tmub1 表達(dá)量增加，過(guò)表達(dá)效果滿意。而增殖相關(guān)蛋白，如微小染色體維持蛋白（MCM2）、磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子 3（p-STAT3）、細(xì)胞周期蛋白 D1(cyclin D1)表達(dá)量降低（圖 2.2）。由此可知，Tmub1 在體內(nèi)抑制小鼠肝臟再生。

2.2 A：PH后0h和72h肝組織中Tmub1及增殖相關(guān)蛋白的Western blotting分析。B：g結(jié)果的灰度值統(tǒng)計(jì)圖。**：p < 0.01；*** p < 0.001。n=3。.3.3 組織學(xué)分析提示過(guò)表達(dá)Tmub1組小鼠的增殖水平明顯低于對(duì)照組織學(xué)分析也得到同樣的結(jié)論，Tmub1 抑制了肝細(xì)胞的增殖。在 HE 染色Tmub1 組可見(jiàn)更多的退化肝細(xì)胞(肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)異常滯留)，Ki-67 免疫組 Tmub1 組的增殖水平明顯低于對(duì)照組（圖 2.3）。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R575

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1 解景東;楊寶山;;肝再生機(jī)制研究現(xiàn)況[J];肝臟;2014年12期

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本文編號(hào)：2644512