【摘要】：一、研究背景肝臟各種良惡性疾病常引起肝功能不同程度的損傷。特別在肝臟惡性腫瘤的手術(shù)治療中,肝功能衰竭是患者術(shù)后死亡的一大原因,也是制約晚期肝癌患者進(jìn)行手術(shù)治療的難點之一。目前對于肝功能衰竭的治療常用方法有非生物型人工肝支持治療及肝移植,但這些技術(shù)仍存在諸多局限性,不能很好地解決術(shù)后肝功能衰竭的問題。而過去研究發(fā)現(xiàn)肝臟是一個具有強大的再生能力的器官,在部分肝切除術(shù)(partial hepatectomy,PH)后,肝臟能在較短期內(nèi)通過自身的修復(fù)完全恢復(fù)自身體積和功能~([1]),因此人為調(diào)控肝臟再生使得肝臟恢復(fù)原有功能可作為一種治療肝功能衰竭的有效手段。對于肝臟外科,若能有效調(diào)控肝臟再生,既可避免肝切除術(shù)后可能出現(xiàn)的肝功能衰竭問題,又可拓寬肝切除術(shù)的適應(yīng)癥,為肝臟疾病的治療提供強有力的支持。因此,深入研究肝臟再生過程中肝細(xì)胞增殖機制及肝再生調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的作用是必不可少的�？缒ず头核貥咏Y(jié)構(gòu)域蛋白1(Tmub1),也被稱為肝細(xì)胞臨時穿梭蛋白(HOPS),是一個核質(zhì)穿梭蛋白,包含一個泛素樣結(jié)構(gòu)域、一個出核信號和脯氨酸富集區(qū)~([2])。在肝再生過程的不同時間,Tmub1蛋白大量表達(dá),并改變亞細(xì)胞定位,抑制肝細(xì)胞增殖~([3])。有文獻(xiàn)報道,在肝細(xì)胞增殖過程中,轉(zhuǎn)錄因子C/EBPβ可增強Tmub1的表達(dá)~([3]);Tmub1沉默后導(dǎo)致中心體功能異常,引起細(xì)胞分裂失敗和細(xì)胞周期阻滯~([4]),提示Tmub1可影響細(xì)胞周期進(jìn)程~([5])。Tmub1參加了肝再生調(diào)控網(wǎng)絡(luò),但Tmub1在肝再生調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中起的作用及Tmub1對細(xì)胞增殖的影響機制尚未闡明。二、研究目的1.通過構(gòu)建小鼠70%肝切除模型,并向小鼠轉(zhuǎn)染異位表達(dá)Tmub1質(zhì)粒,在體內(nèi)層面明確Tmub1對肝再生和肝細(xì)胞增殖的影響。2.使用人正常肝細(xì)胞L02,明確Tmub1通過抑制STAT3磷酸化對肝細(xì)胞增殖的影響。3.探討Tmub1與STAT3的相互作用機制。三、材料和方法1.構(gòu)建小鼠70%肝切除再生模型,并分別于術(shù)前2天、術(shù)后1天通過尾靜脈向小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)染Tmub1過表達(dá)質(zhì)粒及陰性對照質(zhì)粒,并設(shè)立假手術(shù)組(不行肝切除術(shù),僅開腹并游離肝周韌帶)。通過檢測術(shù)后3天小鼠肝重/體重、血清AST/ALT水平,評估各組小鼠肝切除術(shù)后肝再生情況,使用Western Blotting技術(shù)檢測增殖相關(guān)蛋白表達(dá)情況,并采用免疫組化和HE染色分析各組小鼠肝損傷情況和肝細(xì)胞增殖情況,明確Tmub1對小鼠肝再生的影響以及對STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)量的影響。2.使用人Tmub1過表達(dá)質(zhì)粒及shRNA,瞬時轉(zhuǎn)染人正常肝細(xì)胞L02后通過EdU檢測Tmub1異位表達(dá)對L02細(xì)胞增殖能力的影響,WB檢測Tmub1異位表達(dá)對STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,免疫熒光和WB檢測Tmub1異位表達(dá)對STAT3和p-STAT3亞細(xì)胞定位的影響。3.通過相應(yīng)Rescue實驗,觀察STAT3抑制劑stattic/激動劑OSM對Tmub1誘導(dǎo)的肝細(xì)胞增殖能力的逆轉(zhuǎn)作用。4.通過生物信息學(xué)分析、染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(ChIP)及熒光素酶報告基因?qū)嶒?Luciferase reporter gene assay)探討STAT3對Tmub1表達(dá)的誘導(dǎo)作用,通過免疫共沉淀實驗明確Tmub1與STAT3蛋白的相互作用。5.實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析;計量資料結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間均數(shù)采用t檢驗進(jìn)行比較。P0.05作為顯著統(tǒng)計學(xué)差異的標(biāo)準(zhǔn)。四、結(jié)果1.在肝切除術(shù)后3天,過表達(dá)Tmub1的小鼠肝重/體重比顯著低于陰性對照組及空白組小鼠,提示過表達(dá)Tmub1延緩了小鼠肝臟再生;血清轉(zhuǎn)氨酶檢測提示過表達(dá)Tmub1組小鼠血清ALT、AST水平顯著高于對照組,提示肝功能恢復(fù)情況差;同時,免疫組化及HE染色示Tmub1過表達(dá)組小鼠肝細(xì)胞損傷更為嚴(yán)重,且增殖指標(biāo)Ki-67、p-H3陽性率顯著低于陰性對照組及空白組小鼠;進(jìn)一步的Western Blotting結(jié)果提示STAT3磷酸化水平及MCM2、Cyclin D1的表達(dá)量在過表達(dá)Tmub1小鼠中明顯降低,提示Tmub1顯著抑制了肝再生過程中的肝細(xì)胞增殖。2.Western Blotting提示過表達(dá)Tmub1顯著降低STAT3磷酸化水平及cyclin D1和c-myc的表達(dá)量而不影響STAT3總蛋白水平;反之干擾Tmub1表達(dá)后,STAT3磷酸化水平及cyclin D1和c-myc的表達(dá)量顯著增高,但總STAT3表達(dá)量不變。免疫熒光提示Tmub1不影響STAT3的亞細(xì)胞定位。3.EdU細(xì)胞增殖實驗提示,過表達(dá)Tmub1的人正常肝細(xì)胞L02增殖受到顯著抑制,但在加入STAT3激動劑OSM后細(xì)胞增殖情況恢復(fù);干擾Tmub1表達(dá)可顯著促進(jìn)L02細(xì)胞增殖,而該效應(yīng)可被STAT3抑制劑stattic所回復(fù)。Western Blotting結(jié)果同樣提示過表達(dá)Tmub1引起STAT3磷酸化水平及cyclin D1和c-myc的表達(dá)量降低,可在加入OSM之后恢復(fù)。反之亦然。4.生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)人的Tmub1基因啟動子區(qū)域存在一個STAT3的結(jié)合位點。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(ChIP)及熒光素酶報告基因?qū)嶒?Luciferase reporter gene assay)提示STAT3可與Tmub1啟動子相結(jié)合,并提高Tmub1啟動子的活性、增強Tmub1的表達(dá)。5.利用免疫共沉淀技術(shù)(co-IP),我們發(fā)現(xiàn)Tmub1與STAT3可形成蛋白質(zhì)復(fù)合物。五、結(jié)論Tmub1是一個肝再生的負(fù)相調(diào)控因子。STAT3可誘導(dǎo)Tmub1的基因表達(dá),而Tmub1又可通過結(jié)合并抑制STAT3的磷酸化激活來發(fā)揮其對肝細(xì)胞增殖的抑制作用。Tmub1和STAT3可能形成了一個肝細(xì)胞增殖過程中的負(fù)反饋調(diào)控環(huán)路來調(diào)控肝再生的進(jìn)程。
【圖文】：

陸軍軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文18圖2.1 過表達(dá)Tmub1抑制小鼠肝切除術(shù)后肝臟再生。A：體內(nèi)轉(zhuǎn)染及肝部分切除術(shù)（PH）實驗計劃示意圖；B: 在PH后3天后，Tmub1過表達(dá)組和陰性對照組小鼠肝體重比。以假手術(shù)組小鼠為對照；C：PH3天后，血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）及谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）水平。*：p < 0.05；**：p <0.01；***：p < 0.001。n=3。2.3.2 過表達(dá) Tmub1 抑制增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)我們將 PH 后 0 時及 3 天獲得的再生肝組織進(jìn)行 Western Blotting 檢測及組織學(xué)分析。與對照組相比，通過體內(nèi)轉(zhuǎn)染過表達(dá) Tmub1 質(zhì)粒，，成功使小鼠肝臟內(nèi) Tmub1 表達(dá)量增加，過表達(dá)效果滿意。而增殖相關(guān)蛋白，如微小染色體維持蛋白（MCM2）、磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子 3（p-STAT3）、細(xì)胞周期蛋白 D1(cyclin D1)表達(dá)量降低（圖 2.2）。由此可知，Tmub1 在體內(nèi)抑制小鼠肝臟再生。

2.2 A：PH后0h和72h肝組織中Tmub1及增殖相關(guān)蛋白的Western blotting分析。B：g結(jié)果的灰度值統(tǒng)計圖。**：p < 0.01；*** p < 0.001。n=3。.3.3 組織學(xué)分析提示過表達(dá)Tmub1組小鼠的增殖水平明顯低于對照組織學(xué)分析也得到同樣的結(jié)論，Tmub1 抑制了肝細(xì)胞的增殖。在 HE 染色Tmub1 組可見更多的退化肝細(xì)胞(肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)異常滯留)，Ki-67 免疫組 Tmub1 組的增殖水平明顯低于對照組（圖 2.3）。
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R575

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1 解景東;楊寶山;;肝再生機制研究現(xiàn)況[J];肝臟;2014年12期

2 李瀚e

本文編號：2644512