【摘要】：目的潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種侵襲結(jié)腸黏膜的炎癥,目前病因尚不明確,具有難治愈、易復(fù)發(fā),易癌變的特點。UC的病因尚未明確,越來越多的研究顯示腸上皮細(xì)胞(IEC)在UC中具有重要的調(diào)控作用。腸上皮細(xì)胞的功能具有多樣性,可在腸道表面形成緊密連接,構(gòu)成腸道與外界環(huán)境的生理性屏障,還可分泌粘蛋白等進(jìn)一步阻止病原微生物的入侵。IEC細(xì)胞上表達(dá)模式識別受體(PRR)可識別腸道微生物的刺激,從而激發(fā)炎癥反應(yīng),并且能分泌一系列細(xì)胞因子,調(diào)節(jié)腸道微環(huán)境。前期的研究中,我們通過觀察UC/CAC(Colitis associated cancer)小鼠模型炎癥癌變的過程,發(fā)現(xiàn)其中Eftud2蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。Eftud2是剪接體蛋白U5的組成成分,能夠促進(jìn)前體RNA剪接為成熟的RNA。Eftud2也可在免疫反應(yīng)中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞因子分泌,還可影響MyD88信號通路。本實驗意在探究Eftud2能否通過調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞的功能,進(jìn)而影響UC的發(fā)生發(fā)展。方法使用Cre/Loxp系統(tǒng)建立腸上皮特異性敲除Eftud2的小鼠模型,分別在體內(nèi)、外進(jìn)行機(jī)制的研究與探索。體外研究中,分選Eftud2特異性敲除小鼠的腸上皮細(xì)胞,經(jīng)LPS刺激后用ELISA法檢測其炎癥相關(guān)細(xì)胞因子釋放;Western Blot法檢測NF-κB信號通路有關(guān)蛋白的表達(dá)與正常小鼠腸上皮細(xì)胞是否存在差異。體內(nèi)研究中,在生理情況下檢測Eftud2對腸上皮細(xì)胞的屏障功能及腸上皮細(xì)胞的生長是否有影響;建立DSS誘導(dǎo)的UC模型,在病理情況下檢測UC相關(guān)評價指標(biāo)及病理表型是否存在差異。結(jié)果通過Western Blot和組化實驗驗證,證實腸上皮特異性敲除Eftud2小鼠模型建立成功。體外實驗結(jié)果顯示,經(jīng)LPS刺激后,Eftud2特異性敲除的腸上皮細(xì)胞與正常腸上皮細(xì)胞相比,IL-1β、IL-6、IL-17A和TNF-α四種細(xì)胞因子的釋放無顯著性差異,NF-κB p65亞基磷酸化水平也沒有顯著性差異。體內(nèi)實驗結(jié)果表明,Eftud2特異性敲除的小鼠腸上皮細(xì)胞生長未見異常;在DSS誘導(dǎo)的UC模型中,腸上皮特異性敲除Eftud2的小鼠與野生型小鼠在體重下降、攝食量下降、死亡率、便血情況及腸道損傷程度等UC的評價指標(biāo)中均無顯著性差異。綜上,我們的研究結(jié)果表明,Eftud2未能通過影響腸上皮細(xì)胞的功能而影響UC進(jìn)程。
【圖文】：

一、 腸上皮特異性敲除 Eftud2 小鼠的構(gòu)建與鑒定re-loxp 系統(tǒng)基本作用原理Cre 重組酶是大腸桿菌噬菌體 P1 中由 Cre 基因編碼的 343 個氨基酸組成的質(zhì)，它能夠識別特異性 loxp 序列，并根據(jù) loxp 序列的位置和方向介導(dǎo)特異組反應(yīng)。Loxp序列是 Cre 重組酶的特異性識別位點，序列為：5’-TAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT-3’;3’-ATTGAAGCATATCG-TATGTAATATGCTTCAATA-5’。具有兩個 13bp 反向序列和一個 8bp的不對稱間隔序列，具有方向性。當(dāng)兩個 loxp 序列位于同一NA 鏈且方向相同時，，Cre 重組酶能夠敲除 loxp 序列之間的 DNA 片段[6]。如-1 所示 Cre-loxp 作用原理。

Eftud2loxp+/-小鼠自交，得到 F1 代小鼠經(jīng)鑒定選取純和 Eftud2lo 代小鼠與基因型為 Villincre+/-交配，得到 F2 代小鼠經(jīng)鑒定選取基/-Eftud2loxp+/-的子代小鼠進(jìn)行自交，最終得到實驗用小鼠的基因/-Eftud2loxp+/+。將該小鼠與基因型為 Eftud2loxp+/+不攜帶 Cre 酶的組織特異性鑒定后即可用于實驗。實驗組小鼠基因型為 Villinp+/+，即腸上皮特異性敲除小鼠表示為 KO（Knockout）組，對 Eftud2loxp+/+，即不攜帶 Cre 基因的純合 loxp 小鼠表示為 WT（。如圖 1-2 所示小鼠交配方案及基因型示意圖。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R574.62

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 農(nóng)輝;黃雪;;葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型的研究進(jìn)展[J];世界華人消化雜志;2014年22期

本文編號：2644313