【摘要】： 經(jīng)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)標記后的病毒，可以在活細胞中顯示并研究它們。但GFP并不適合標記乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)，因為HBV是一種體積較小的病毒體，它的內(nèi)部空間狹小，無法容納GFP這樣一個含有238個氨基酸的大片段的摻入。最近有報道稱：融合了四半胱氨酸標簽(tetracysteine tag，TC tag)的目的蛋白可以被一種雙砷熒光染料在活細胞中特異地標記。這種雙砷標記技術(shù)為活細胞中HBV的熒光示蹤和研究又提供了新的機遇。 【目的】制造重組的經(jīng)雙砷染料標記的熒光HBV，從而在活細胞中示蹤并研究HBV。 【方法】應(yīng)用分子克隆和PCR定點突變技術(shù)，以含1.3倍HBV基因組的載體為模板，在其編碼的核心蛋白的免疫優(yōu)勢c／el表位(the immunodominant c／el site)附近插入一個特殊的TC標簽，這個標簽可以同雙砷熒光染料特異地結(jié)合。構(gòu)建所得的重組的HBV載體被轉(zhuǎn)染入HepG2細胞中用于表達TC嵌合型核心蛋白。應(yīng)用Westernblotting，免疫熒光以及雙砷標記分析這種蛋白的表達和亞細胞定位。此外，表達這種TC嵌合型核心蛋白的細胞用雙砷染料印跡后，繼續(xù)被培養(yǎng)，用于制造熒光HBV病毒體。應(yīng)用投射電子顯微鏡(transmission electron microscopy，TEM)和激光共聚焦顯微鏡鑒定熒光HBV病毒體的產(chǎn)生，并進一步調(diào)查這些熒光病毒對DMSO處理過的HepG2細胞的感染性。最終，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡在活細胞中直接觀察熒光HBV的轉(zhuǎn)運。 【結(jié)果】編碼TC嵌合型核心蛋白的HBV載體被成功構(gòu)建，轉(zhuǎn)染了這些HBV載體的細胞可以表達TC嵌合型核心蛋白并制造成熟的HBV病毒體。而且，細胞中結(jié)合了雙砷染料的TC嵌合型核心蛋白可以特異地發(fā)出熒光，并組裝入HBV核心顆粒中進而形成熒光HBV病毒體，這些病毒體保留了同野生型HBV病毒體類似的感染性。這些熒光HBV在活細胞中的轉(zhuǎn)運可以通過激光共聚焦顯微鏡，直觀而便捷地觀察到。 【結(jié)論】本研究應(yīng)用雙砷標記技術(shù)，，首次制造出了熒光HBV病毒體，它讓我們可以在活細胞中示蹤并研究HBV的轉(zhuǎn)運。這種熒光HBV可以作為一種非常有價值的工具，用于在活細胞中深入地研究HBV生命周期中的動態(tài)過程以及病毒與宿主之間的相互作用。
【圖文】：

圖1編碼TC嵌合型核心蛋白的HBV載體的構(gòu)建1.3倍HBV基因組的載體，HBV各基因區(qū)己被示出。KP，，I和E被引入到pTHBV1.3的HBVC基因中，再將編碼TC標簽的寡核個位點間，構(gòu)建出編碼TC嵌合型核心蛋白的HBV載體。ConstruetionofHBVveetoreneodingTCtaggedeoreProteinmidPTHBVI.315arePlieationeomPetentPlasmideontaininga1.chgenesregionofHBVinthePlasmidPTHBVI.3wasindieatedlandEeoRV，wereintrodueedintoHBVeoregeneofthePoligonueleotideseneodingTCtagwereelonedintotheKP，;1andEBVveetorseneodingTC硯aggedeoreProteinwereeonstrueted.

pTHBVI.3翎TCI的圖譜
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R512.62

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王中德,史良如,穆海燕,孫可芳,陳善華;單抗的熒光標記及其在競爭抑制試驗中的應(yīng)用[J];現(xiàn)代免疫學;1988年06期

2 楊軍慧,蔣瑞華;加熱法快速進行T-HCl熒光標記精子的研究[J];刑事技術(shù);1994年04期

3 林海，龔肖崎，鐘紀根，陳駿;一種新的測定血管壁通透性的方法[J];微循環(huán)學雜志;1995年03期

4 陳瑩,黃惠民,史桂英,徐清,邱麗君;血小板膜糖蛋白的流式細胞儀測定[J];上海第二醫(yī)科大學學報;1997年02期

5 ;應(yīng)用熒光標記PCR產(chǎn)物的DHPLC進行DNA突變檢測[J];基礎(chǔ)醫(yī)學與臨床;1999年03期

6 黃智,王汝祥,劉虎生,趙靜,劉麗琦,劉雪梅,張曉宇,吳栩濤;熒光標記兔抗淋球菌IgG的研制[J];中國公共衛(wèi)生;2000年07期

7 朱冰,劉殿武,崔俊生,郭麗麗;熒光標記mRNA差異顯示法研究中藥對肝星狀細胞基因表達的影響[J];山東中醫(yī)雜志;2003年02期

8 李鴻梅,劉含智,張皓,朱貴賓,王麗萍,楊柏,李惟;量子點熒光標記在重組噬菌體表面展示肽與胰島素受體相互作用中的應(yīng)用[J];高等學校化學學報;2004年05期

9 周東蕊;楊利國;唐祖明;郭小英;張春秀;陸祖宏;;白色念珠菌和鼠傷寒沙門氏菌的熒光標記及其對細胞粘附作用的影響[J];中國獸醫(yī)學報;2006年02期

10 李心群;許文;;豬苓多糖通過Toll樣受體4對小鼠骨髓來源樹突狀細胞作用研究[J];中草藥;2011年01期

相關(guān)會議論文 前10條

1 高國強;;大黃魚耐低溫性狀相關(guān)微衛(wèi)星標記的篩選[A];2009年中國水產(chǎn)學會學術(shù)年會論文摘要集[C];2009年

2 石慧;袁媛;何曉曉;王柯敏;劉丹;;基于二氧化硅熒光納米顆粒的新型溶酶體標記物研究[A];第六屆全國化學生物學學術(shù)會議論文摘要集[C];2009年

3 錢慧敏;顧月清;;蛋白類藥物的近紅外熒光標記[A];中國光學學會2006年學術(shù)大會論文摘要集[C];2006年

4 王利英;夏勉;溫東輝;李毅;;一株無色桿菌Ochrobactrum anthropi CGMCC 1649質(zhì)粒pW240及其衍生質(zhì)粒的構(gòu)建及應(yīng)用[A];第二屆中國青年學者微生物遺傳學學術(shù)研討會論文集[C];2006年

5 李藝松;柳偉君;顧�？�;;伍氏游仆蟲皮層微管類細胞骨架的熒光標記[A];2008年上海市動物學會學術(shù)會議論文集（二）[C];2008年

6 馮啟松;董麗杰;謝海安;熊傳溪;;可用于生物熒光標記的水溶性量子點的制備及表征[A];2009年全國高分子學術(shù)論文報告會論文摘要集（上冊）[C];2009年

7 揚樹長;李生廣;林治煥;;利用熒光標記方法研究無機磷和疊氮納對線粒體F_1-ATPase構(gòu)象的影響[A];第五屆全國光生物學學術(shù)討論會論文摘要集[C];2000年

8 府壽寬;汪長春;楊武利;鄧勇輝;;熒光標記的磁性聚(N-異丙基丙烯酰胺)微球[A];2005年全國高分子學術(shù)論文報告會論文摘要集[C];2005年

9 陳磊;姚祝軍;;生物固氮信息分子Naringenin的熒光標記研究[A];中國化學會第二十五屆學術(shù)年會論文摘要集（上冊）[C];2006年

10 王小波;周明;費浩;;一種基于環(huán)金屬銥化合物與組氨酸結(jié)合的新型多肽標記方式及用于細胞穿膜肽的成像研究[A];中國化學會第27屆學術(shù)年會第03分會場摘要集[C];2010年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 記者 劉云濤;我國首次利用熒光偏振技術(shù)篩選新藥[N];中國醫(yī)藥報;2005年

2 王全楚;“量子點”熒光標記初露端倪[N];健康報;2005年

3 李建平;我首例熒光轉(zhuǎn)基因克隆豬,又“生”兩頭熒光豬崽[N];新華每日電訊;2008年

4 宗成;納米稀土熒光生物標記新材料問世[N];中國化工報;2005年

5 記者　尹傳紅;蘇格蘭科學家找到基因行為研究新法[N];科技日報;2006年

6 成杰;復(fù)方丹參合劑能有效預(yù)防骨丟失[N];中國醫(yī)藥報;2006年

7 記者　孫洪磊;我國首次投放帶標記魚苗[N];人民日報海外版;2006年

8 本報記者 劉海英;今天你拍細菌了嗎？[N];科技日報;2009年

9 記者 朱國旺;“流式中國30年”高峰論壇召開[N];中國醫(yī)藥報;2010年

10 何坤堯;生物芯片儀器研制項目獲川科技進步二等獎[N];中國醫(yī)藥報;2006年

相關(guān)博士學位論文 前10條

1 林園園;活細胞內(nèi)示蹤乙型肝炎病毒的實驗研究[D];華中科技大學;2009年

2 呂志華;海洋多糖藥物PS916的熒光標記及其藥代動力學研究[D];中國海洋大學;2008年

3 周彬;乙型肝炎病毒CD重組體的分布以及臨床和病毒學特點研究[D];南方醫(yī)科大學;2008年

4 劉軍安;聚酰胺—胺型樹狀大分子的合成及性能研究[D];華中科技大學;2007年

5 郭威;慢性重型乙型肝炎患者HBV BCP/前C區(qū)基因變異及Th1/Th2免疫狀態(tài)的研究[D];華中科技大學;2006年

6 李立人;骨髓基質(zhì)干細胞誘導分化為胰腺β細胞的研究[D];蘇州大學;2005年

7 齊巖峰;人促紅細胞生成素小肽模擬物研究[D];吉林大學;2006年

8 崔福英;用于胰島素口服給藥和腫瘤靶向的殼聚糖衍生物接枝納米粒[D];復(fù)旦大學;2008年

9 劉文靜;新型快速熒光動態(tài)圖像攝錄與處理分析系統(tǒng)及其對活細胞的應(yīng)用研究[D];暨南大學;2006年

10 邢叔星;新型點接觸鎖定加壓接骨板的研制與初步實驗研究[D];第三軍醫(yī)大學;2007年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 寧巧玉;染料及配合物摻SiO_2納米粒子的熒光性質(zhì)研究及其免疫分析[D];暨南大學;2006年

2 王小磊;智能激光掃描共聚焦顯微鏡的設(shè)計及其在微生物分析中的應(yīng)用[D];南昌大學;2006年

3 賈可;光纖生物傳感器在膽堿和興奮劑檢測中的應(yīng)用[D];東南大學;2005年

4 賈淑芬;DNA計算在整數(shù)規(guī)劃問題中的應(yīng)用[D];暨南大學;2007年

5 華曉鋒;量子點與生物分子的偶聯(lián)及其應(yīng)用[D];華中科技大學;2006年

6 郝建玉;量子點的水溶性修飾及標記朊蛋白[D];西南大學;2009年

7 張晶慧;CdSe量子點的合成及其用于環(huán)境中污染物的檢測[D];東華大學;2009年

8 葉麗丹;球毛殼菌與綠色木霉的熒光標記及生防特性研究[D];浙江大學;2006年

9 朱旭明;克氏螯蝦殼聚糖抗菌機制的初步研究[D];江蘇大學;2009年

10 陳瀟瀅;3α-羥類固醇脫氫酶抗體的制備及標記[D];長春理工大學;2009年

本文編號：2644318