【摘要】： 經(jīng)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)標(biāo)記后的病毒，可以在活細(xì)胞中顯示并研究它們。但GFP并不適合標(biāo)記乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)，因?yàn)镠BV是一種體積較小的病毒體，它的內(nèi)部空間狹小，無(wú)法容納GFP這樣一個(gè)含有238個(gè)氨基酸的大片段的摻入。最近有報(bào)道稱(chēng)：融合了四半胱氨酸標(biāo)簽(tetracysteine tag，TC tag)的目的蛋白可以被一種雙砷熒光染料在活細(xì)胞中特異地標(biāo)記。這種雙砷標(biāo)記技術(shù)為活細(xì)胞中HBV的熒光示蹤和研究又提供了新的機(jī)遇。 【目的】制造重組的經(jīng)雙砷染料標(biāo)記的熒光HBV，從而在活細(xì)胞中示蹤并研究HBV。 【方法】應(yīng)用分子克隆和PCR定點(diǎn)突變技術(shù)，以含1.3倍HBV基因組的載體為模板，在其編碼的核心蛋白的免疫優(yōu)勢(shì)c／el表位(the immunodominant c／el site)附近插入一個(gè)特殊的TC標(biāo)簽，這個(gè)標(biāo)簽可以同雙砷熒光染料特異地結(jié)合。構(gòu)建所得的重組的HBV載體被轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞中用于表達(dá)TC嵌合型核心蛋白。應(yīng)用Westernblotting，免疫熒光以及雙砷標(biāo)記分析這種蛋白的表達(dá)和亞細(xì)胞定位。此外，表達(dá)這種TC嵌合型核心蛋白的細(xì)胞用雙砷染料印跡后，繼續(xù)被培養(yǎng)，用于制造熒光HBV病毒體。應(yīng)用投射電子顯微鏡(transmission electron microscopy，TEM)和激光共聚焦顯微鏡鑒定熒光HBV病毒體的產(chǎn)生，并進(jìn)一步調(diào)查這些熒光病毒對(duì)DMSO處理過(guò)的HepG2細(xì)胞的感染性。最終，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡在活細(xì)胞中直接觀察熒光HBV的轉(zhuǎn)運(yùn)。 【結(jié)果】編碼TC嵌合型核心蛋白的HBV載體被成功構(gòu)建，轉(zhuǎn)染了這些HBV載體的細(xì)胞可以表達(dá)TC嵌合型核心蛋白并制造成熟的HBV病毒體。而且，細(xì)胞中結(jié)合了雙砷染料的TC嵌合型核心蛋白可以特異地發(fā)出熒光，并組裝入HBV核心顆粒中進(jìn)而形成熒光HBV病毒體，這些病毒體保留了同野生型HBV病毒體類(lèi)似的感染性。這些熒光HBV在活細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運(yùn)可以通過(guò)激光共聚焦顯微鏡，直觀而便捷地觀察到。 【結(jié)論】本研究應(yīng)用雙砷標(biāo)記技術(shù)，，首次制造出了熒光HBV病毒體，它讓我們可以在活細(xì)胞中示蹤并研究HBV的轉(zhuǎn)運(yùn)。這種熒光HBV可以作為一種非常有價(jià)值的工具，用于在活細(xì)胞中深入地研究HBV生命周期中的動(dòng)態(tài)過(guò)程以及病毒與宿主之間的相互作用。
【圖文】：

圖1編碼TC嵌合型核心蛋白的HBV載體的構(gòu)建1.3倍HBV基因組的載體，HBV各基因區(qū)己被示出。KP，，I和E被引入到pTHBV1.3的HBVC基因中，再將編碼TC標(biāo)簽的寡核個(gè)位點(diǎn)間，構(gòu)建出編碼TC嵌合型核心蛋白的HBV載體。ConstruetionofHBVveetoreneodingTCtaggedeoreProteinmidPTHBVI.315arePlieationeomPetentPlasmideontaininga1.chgenesregionofHBVinthePlasmidPTHBVI.3wasindieatedlandEeoRV，wereintrodueedintoHBVeoregeneofthePoligonueleotideseneodingTCtagwereelonedintotheKP，;1andEBVveetorseneodingTC硯aggedeoreProteinwereeonstrueted.

pTHBVI.3翎TCI的圖譜
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類(lèi)號(hào)】：R512.62

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王中德,史良如,穆海燕,孫可芳,陳善華;單抗的熒光標(biāo)記及其在競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)中的應(yīng)用[J];現(xiàn)代免疫學(xué);1988年06期

2 楊軍慧,蔣瑞華;加熱法快速進(jìn)行T-HCl熒光標(biāo)記精子的研究[J];刑事技術(shù);1994年04期

3 林海，龔肖崎，鐘紀(jì)根，陳駿;一種新的測(cè)定血管壁通透性的方法[J];微循環(huán)學(xué)雜志;1995年03期

4 陳瑩,黃惠民,史桂英,徐清,邱麗君;血小板膜糖蛋白的流式細(xì)胞儀測(cè)定[J];上海第二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);1997年02期

5 ;應(yīng)用熒光標(biāo)記PCR產(chǎn)物的DHPLC進(jìn)行DNA突變檢測(cè)[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;1999年03期

6 黃智,王汝祥,劉虎生,趙靜,劉麗琦,劉雪梅,張曉宇,吳栩濤;熒光標(biāo)記兔抗淋球菌IgG的研制[J];中國(guó)公共衛(wèi)生;2000年07期

7 朱冰,劉殿武,崔俊生,郭麗麗;熒光標(biāo)記mRNA差異顯示法研究中藥對(duì)肝星狀細(xì)胞基因表達(dá)的影響[J];山東中醫(yī)雜志;2003年02期

8 李鴻梅,劉含智,張皓,朱貴賓,王麗萍,楊柏,李惟;量子點(diǎn)熒光標(biāo)記在重組噬菌體表面展示肽與胰島素受體相互作用中的應(yīng)用[J];高等學(xué)�；瘜W(xué)學(xué)報(bào);2004年05期

9 周東蕊;楊利國(guó);唐祖明;郭小英;張春秀;陸祖宏;;白色念珠菌和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的熒光標(biāo)記及其對(duì)細(xì)胞粘附作用的影響[J];中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào);2006年02期

10 李心群;許文;;豬苓多糖通過(guò)Toll樣受體4對(duì)小鼠骨髓來(lái)源樹(shù)突狀細(xì)胞作用研究[J];中草藥;2011年01期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 高國(guó)強(qiáng);;大黃魚(yú)耐低溫性狀相關(guān)微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選[A];2009年中國(guó)水產(chǎn)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C];2009年

2 石慧;袁媛;何曉曉;王柯敏;劉丹;;基于二氧化硅熒光納米顆粒的新型溶酶體標(biāo)記物研究[A];第六屆全國(guó)化學(xué)生物學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2009年

3 錢(qián)慧敏;顧月清;;蛋白類(lèi)藥物的近紅外熒光標(biāo)記[A];中國(guó)光學(xué)學(xué)會(huì)2006年學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要集[C];2006年

4 王利英;夏勉;溫東輝;李毅;;一株無(wú)色桿菌Ochrobactrum anthropi CGMCC 1649質(zhì)粒pW240及其衍生質(zhì)粒的構(gòu)建及應(yīng)用[A];第二屆中國(guó)青年學(xué)者微生物遺傳學(xué)學(xué)術(shù)研討會(huì)論文集[C];2006年

5 李藝松;柳偉君;顧�？�;;伍氏游仆蟲(chóng)皮層微管類(lèi)細(xì)胞骨架的熒光標(biāo)記[A];2008年上海市動(dòng)物學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)會(huì)議論文集（二）[C];2008年

6 馮啟松;董麗杰;謝海安;熊傳溪;;可用于生物熒光標(biāo)記的水溶性量子點(diǎn)的制備及表征[A];2009年全國(guó)高分子學(xué)術(shù)論文報(bào)告會(huì)論文摘要集（上冊(cè)）[C];2009年

7 揚(yáng)樹(shù)長(zhǎng);李生廣;林治煥;;利用熒光標(biāo)記方法研究無(wú)機(jī)磷和疊氮納對(duì)線粒體F_1-ATPase構(gòu)象的影響[A];第五屆全國(guó)光生物學(xué)學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要集[C];2000年

8 府壽寬;汪長(zhǎng)春;楊武利;鄧勇輝;;熒光標(biāo)記的磁性聚(N-異丙基丙烯酰胺)微球[A];2005年全國(guó)高分子學(xué)術(shù)論文報(bào)告會(huì)論文摘要集[C];2005年

9 陳磊;姚祝軍;;生物固氮信息分子Naringenin的熒光標(biāo)記研究[A];中國(guó)化學(xué)會(huì)第二十五屆學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集（上冊(cè)）[C];2006年

10 王小波;周明;費(fèi)浩;;一種基于環(huán)金屬銥化合物與組氨酸結(jié)合的新型多肽標(biāo)記方式及用于細(xì)胞穿膜肽的成像研究[A];中國(guó)化學(xué)會(huì)第27屆學(xué)術(shù)年會(huì)第03分會(huì)場(chǎng)摘要集[C];2010年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 記者 劉云濤;我國(guó)首次利用熒光偏振技術(shù)篩選新藥[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2005年

2 王全楚;“量子點(diǎn)”熒光標(biāo)記初露端倪[N];健康報(bào);2005年

3 李建平;我首例熒光轉(zhuǎn)基因克隆豬,又“生”兩頭熒光豬崽[N];新華每日電訊;2008年

4 宗成;納米稀土熒光生物標(biāo)記新材料問(wèn)世[N];中國(guó)化工報(bào);2005年

5 記者　尹傳紅;蘇格蘭科學(xué)家找到基因行為研究新法[N];科技日?qǐng)?bào);2006年

6 成杰;復(fù)方丹參合劑能有效預(yù)防骨丟失[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2006年

7 記者　孫洪磊;我國(guó)首次投放帶標(biāo)記魚(yú)苗[N];人民日?qǐng)?bào)海外版;2006年

8 本報(bào)記者 劉海英;今天你拍細(xì)菌了嗎？[N];科技日?qǐng)?bào);2009年

9 記者 朱國(guó)旺;“流式中國(guó)30年”高峰論壇召開(kāi)[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2010年

10 何坤堯;生物芯片儀器研制項(xiàng)目獲川科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2006年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 林園園;活細(xì)胞內(nèi)示蹤乙型肝炎病毒的實(shí)驗(yàn)研究[D];華中科技大學(xué);2009年

2 呂志華;海洋多糖藥物PS916的熒光標(biāo)記及其藥代動(dòng)力學(xué)研究[D];中國(guó)海洋大學(xué);2008年

3 周彬;乙型肝炎病毒CD重組體的分布以及臨床和病毒學(xué)特點(diǎn)研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2008年

4 劉軍安;聚酰胺—胺型樹(shù)狀大分子的合成及性能研究[D];華中科技大學(xué);2007年

5 郭威;慢性重型乙型肝炎患者HBV BCP/前C區(qū)基因變異及Th1/Th2免疫狀態(tài)的研究[D];華中科技大學(xué);2006年

6 李立人;骨髓基質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰腺β細(xì)胞的研究[D];蘇州大學(xué);2005年

7 齊巖峰;人促紅細(xì)胞生成素小肽模擬物研究[D];吉林大學(xué);2006年

8 崔福英;用于胰島素口服給藥和腫瘤靶向的殼聚糖衍生物接枝納米粒[D];復(fù)旦大學(xué);2008年

9 劉文靜;新型快速熒光動(dòng)態(tài)圖像攝錄與處理分析系統(tǒng)及其對(duì)活細(xì)胞的應(yīng)用研究[D];暨南大學(xué);2006年

10 邢叔星;新型點(diǎn)接觸鎖定加壓接骨板的研制與初步實(shí)驗(yàn)研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2007年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 寧巧玉;染料及配合物摻SiO_2納米粒子的熒光性質(zhì)研究及其免疫分析[D];暨南大學(xué);2006年

2 王小磊;智能激光掃描共聚焦顯微鏡的設(shè)計(jì)及其在微生物分析中的應(yīng)用[D];南昌大學(xué);2006年

3 賈可;光纖生物傳感器在膽堿和興奮劑檢測(cè)中的應(yīng)用[D];東南大學(xué);2005年

4 賈淑芬;DNA計(jì)算在整數(shù)規(guī)劃問(wèn)題中的應(yīng)用[D];暨南大學(xué);2007年

5 華曉鋒;量子點(diǎn)與生物分子的偶聯(lián)及其應(yīng)用[D];華中科技大學(xué);2006年

6 郝建玉;量子點(diǎn)的水溶性修飾及標(biāo)記朊蛋白[D];西南大學(xué);2009年

7 張晶慧;CdSe量子點(diǎn)的合成及其用于環(huán)境中污染物的檢測(cè)[D];東華大學(xué);2009年

8 葉麗丹;球毛殼菌與綠色木霉的熒光標(biāo)記及生防特性研究[D];浙江大學(xué);2006年

9 朱旭明;克氏螯蝦殼聚糖抗菌機(jī)制的初步研究[D];江蘇大學(xué);2009年

10 陳瀟瀅;3α-羥類(lèi)固醇脫氫酶抗體的制備及標(biāo)記[D];長(zhǎng)春理工大學(xué);2009年

本文編號(hào)：2644318