【摘要】：Obestatin(肥胖抑制素)是最近從大鼠胃組織中發(fā)現(xiàn)的一種新的腦腸肽。它是一種ghrelin相關肽，與ghrelin來自同一基因。obestatin與ghrelin在調(diào)節(jié)攝食、胃腸生理等方面作用完全相反，被認為是一對“陰陽”肽。ghrelin也稱為食欲刺激素，是一種由23個氨基酸組成的腦腸肽，生長激素促分泌素受體（growth hormone secretagogue receptor，GHSR）為其受體，ghrelin對胰腺外分泌也具有重要的調(diào)節(jié)作用，主要表現(xiàn)為促進胰腺外分泌，其機制是通過迷走-迷走神經(jīng)通路發(fā)揮作用的。雖然obestatin和ghrelin來源于同一前體proghrelin，但obestatin自發(fā)現(xiàn)以來就充滿了各種爭議，2005年，Zhang等首先在胃黏膜中發(fā)現(xiàn)并命名了obestatin，在最初的功能研究中，腹腔和側(cè)腦室注射人源性obestatin可以抑制大鼠的食欲，減少體重，進一步的研究發(fā)現(xiàn)：obestatin可以抑制渴感和焦慮、提高大鼠的記憶力、抑制前脂肪細胞的增長、控制機體的水代謝。在人體的研究當中，部分研究者發(fā)現(xiàn)在肥胖人群里，胃黏膜中obestatin表達量和血循環(huán)中obestatin含量均出現(xiàn)減少，因此他們推測obestatin在調(diào)節(jié)機體能量代謝方面發(fā)揮了重要作用，是ghrelin的拮抗劑。盡管有以上證據(jù)證明obestatin存在生物學作用，但絕大多數(shù)研究應用了大劑量范圍的obestatin、不同的實驗方法、不同的動物及不同來源的obestatin并未得出相同結(jié)論，因此有研究者提出應該重新命名obestatin。除了對obestatin生物學功能方面存在疑問外，對其受體也存在著爭論：其發(fā)現(xiàn)者首次報道了G蛋白偶聯(lián)受體39（GPR39）是obestatin的天然受體，結(jié)合實驗也證明GPR39廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、外周重要器官，而以胃腸道的含量最高。后來的三個實驗室并未證明GPR39為obestatin的固有受體，因此對發(fā)現(xiàn)者的研究提出了質(zhì)疑，對于以上質(zhì)疑，2007年Zhang重復了自己的實驗并得出他們實驗室不能證明GPR39是obestatin受體的結(jié)論。因此對obestatin的研究還存在以下疑問：(1)在obestatin本身方面：在體內(nèi)這種分子是否真正存在?如果存在到底有怎樣的生理功能功能?是否能拮抗ghrelin的生理作用?它是否受到中樞及其他激素的調(diào)控?(2)在外源性分子方面：人工合成的外源性obestatin多肽分子是否具有與內(nèi)源性分子相同的空間結(jié)構(gòu)及生物活性? (3)在obestatin受體方面：obestatin是否通過GPR39受體發(fā)揮作用？是否還有別的作用途徑?(4)在研究方法方面：利用人工合成的obestatin抗體，檢測到的僅僅是obestatin，還是包括了無實際作用的preproghrelin或proghrelin？ 胰腺的外分泌功能受到中樞神經(jīng)和腸神經(jīng)以及大量的激素和腦腸肽組成的復雜網(wǎng)絡的調(diào)節(jié)，業(yè)已證實：膽囊收縮素（CCK）、促胰液素、胰多肽、ghrelin、血管活性多肽、蛙皮素和胃動素等激素可以刺激胰腺的外分泌；而生長抑素、胰高糖素、降鈣素、腎上腺素和去甲腎上腺素等可以抑制胰腺的外分泌，由于對obestatin功能及受體研究存在著大量的爭論，并且obestatin對胰腺外分泌功能的調(diào)節(jié)作用目前還不清楚。本研究擬采用大鼠離體腺泡、小葉及在體胰腺外分泌功能研究模型，應用分離大鼠離體腺泡細胞和胰腺小葉、靜脈持續(xù)注射、側(cè)腦室內(nèi)微量注射等技術明確obestatin對胰腺外分泌功能的調(diào)節(jié)作用及其機制，并觀察obestatin及其它腦腸肽對大鼠胰腺外分泌調(diào)節(jié)的交互作用，用膽囊收縮素作為陽性對照，從而進一步完善胰腺外分泌調(diào)節(jié)的機制和obestatin的生物學功能。 第一部分一種改良的胰腺腺泡提取方法 目的：對經(jīng)典的Williams提取胰腺腺泡方法進行改良，以期探索一種簡便，經(jīng)濟和穩(wěn)定的胰腺腺泡分離純化的新方法。 方法：雄性SD大鼠，鼠齡8-10w，體重200-250g。在無菌條件下，以3%戊巴比妥鈉，按照15mg/kg劑量腹腔內(nèi)注射麻醉后固定于解剖板上，然后放于75%酒精內(nèi)消毒30分鐘，在無菌操作臺上于劍突下3cm處腹部正中，分層剪開皮膚、腹��；循胃、十二指腸球降部及脾臟之間取出胰腺。室溫下（23℃）在充過氧的Hepes液中將血跡沖洗干凈，并用鑷子輕輕的將胰腺周圍脂肪、淋巴結(jié)以及腹膜剔除。以低濃度Ⅰ型膠原酶（0.3mg/ml）作為腺泡細胞分離液，用帶有1ml注射器針頭的注射器在大鼠胰腺間質(zhì)內(nèi)多點注射使胰腺小葉展開，5分鐘后用小剪刀將其剪成1～2mm碎塊放于含100%氧分離液中震蕩消化50分鐘，然后經(jīng)過過濾，離心、再懸浮等過程成功提取大鼠胰腺腺泡。 結(jié)果：平均每只大鼠可以提取5～6×106個細胞，經(jīng)HE和臺盼藍染色，細胞存活率大于90%，細胞純化率為(70±6)％與王連才方法相比差異無顯著性。 結(jié)論：我們認為本實驗室采用的改進方法是一種簡便，經(jīng)濟和穩(wěn)定的腺泡分離純化方法。 第二部分Obestatin對大鼠胰腺腺泡/小葉淀粉酶影響 目的：研究不同劑量肥胖抑制素對大鼠離體胰腺腺泡及胰腺小葉淀粉酶分泌的影響。 材料與方法：雄性SD大鼠，鼠齡8-10w，體重200-250g，36只。采用改良的Williams法體外分離大鼠胰腺腺泡（方法同第一部分），將胰腺腺泡與不同濃度obestatin（0.1、1、10、30nmol/L）在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h。在對照組腺泡中，加入膽囊收縮素（CCK-8，10-10mol/L）和obestatin共培養(yǎng)1h，測定培養(yǎng)液中上清測定淀粉酶水平，將剩余腺泡細胞放于超聲破碎儀打碎（5分鐘），離心后去上清測定淀粉酶水平。參照Scheele＆Palade法提取胰腺小葉：在無菌條件下，以3%戊巴比妥鈉，按照15mg/kg劑量腹腔內(nèi)注射麻醉后固定于解剖板上，放于75%的酒精內(nèi)消毒30分鐘，在無菌操作臺上于劍突下3cm處腹部正中，分層剪開皮膚、腹肌；循胃、十二指腸球降部及脾臟之間取出胰腺。室溫下（23℃）在充過氧的KHB液中將血跡沖洗干凈，并用鑷子將胰腺周圍脂肪、淋巴結(jié)以及腹膜剔除。分離含有胰腺內(nèi)神經(jīng)末端、胰島細胞及外分泌細胞的胰腺小葉（大小4mm～5mm），胰腺小葉與obestatin共培養(yǎng)30min，對照組中KCL（75mmol/L）和obestatin共培養(yǎng)30min，取上清測定淀粉酶水平，將剩余胰腺小葉組織放于組織勻漿器中打碎，離心后測定上清液中淀粉酶水平。 結(jié)果：obestatin不影響胰腺腺泡和胰腺小葉淀粉酶釋放，且不隨濃度的增高而改變(P 0.05)。CCK-8和KCL能分別刺激胰腺腺泡、胰腺小葉淀粉酶釋放（P0.05），而外源性obestatin對CCK-8和KCL引起的胰腺腺泡和胰腺小葉淀粉酶分泌增加無影響，差異無統(tǒng)計學意義（P 0.05）。 結(jié)論：體外實驗中，外源性obestatin對大鼠胰腺腺泡及胰腺小葉淀粉酶分泌無影響，obestatin對活體大鼠胰腺外分泌影響需要進一步研究。 第三部分靜脈注射obestatin對大鼠胰腺外分泌的影響 目的：采用靜脈持續(xù)注射的方法研究不同劑量肥胖抑制素對大鼠胰腺外分泌功能的影響。 材料與方法：24只SD大鼠隨機分成3組（N=8），麻醉后制作胰腺外分泌模型：所有大鼠用3%戊巴比妥鈉（15mg/kg）腹腔內(nèi)麻醉，麻醉成功后固定于操作板上，放于75%酒精內(nèi)消毒30分鐘，腹中線上逐層切開上腹部約3cm，于胃及十二指腸之間找到胰管及十二指腸乳頭，經(jīng)十二指腸乳頭對側(cè)腸管插入聚乙烯導管（PE-10）約0.5cm,尾靜脈及右側(cè)股動脈留置輸液導管，十二指腸乳頭上端插入PE-10以回輸膽胰混合液（P-BJ）。模型穩(wěn)定30分鐘后開始實驗，每15分鐘經(jīng)胰管插管收集一次P-BJ測定體積，并留取50ul測定蛋白含量，剩余P-BJ經(jīng)由十二指腸回輸。所有大鼠于實驗開始后15分鐘收集一次P-BJ作為基礎分泌。A組和B組于實驗開始15分鐘后分別給予尾靜脈持續(xù)微泵注射1nmolkg-1h-1obestatin和5nmolkg-1h-1 obestatin，45分鐘后給予股靜脈微泵注射400pmolkg-1h-1 CCK-8；C組于實驗開始45分鐘后給予股靜脈注射400pmolkg-1h-1CCK-8作為對照。 結(jié)果：靜脈注射CCK-8 15min后胰腺分泌量開始增高，并于30min后達高峰，而胰腺蛋白也呈相應升高，差異均具有顯著性（P 0.05），單獨靜脈注射obestatin對大鼠胰腺外分泌量及胰液蛋白無影響（P 0.05），obestatin與CCK-8同時注射并不能改變由CCK-8引起的胰腺外分泌及胰液蛋白的增高。結(jié)論：外周靜脈給予CCK-8可增加胰液和胰液蛋白的分泌，靜脈注射obestatin對胰腺外分泌功能無影響，并且不能改變由CCK-8引起的胰液和胰液蛋白的增高。 第四部分腦室微量注射obestatin對大鼠胰腺外分泌的影響 目的采用側(cè)腦室微量注射的方法研究肥胖抑制素對大鼠胰腺外分泌功能的影響。 方法SD大鼠隨機分成3組（A,B,C組），麻醉后制作胰腺外分泌模型：所有大鼠用3%戊巴比妥鈉（15mg/kg）腹腔內(nèi)麻醉，麻醉成功后固定于操作板上，放于75%酒精內(nèi)消毒30分鐘，沿著腹中線逐層切開上腹部約3cm，于胃及十二指腸之間找到胰管及十二指腸乳頭，經(jīng)十二指腸乳頭對側(cè)腸管插入聚乙烯導管（PE-10）約0.5cm,尾靜脈留置輸液導管，十二指腸乳頭上端插入PE-10以回輸膽胰混合液（P-BJ）。模型穩(wěn)定30分鐘后開始實驗，每15分鐘經(jīng)胰管插管收集一次P-BJ測定體積，并留取50ul測定蛋白含量，剩余P-BJ經(jīng)由十二指腸回輸。所有大鼠于實驗開始后15分鐘收集一次P-BJ作為基礎分泌。A組和B組于實驗開始15分鐘后分別給予側(cè)腦室微量注射30nmolkg-1obestatin,C組于實驗開始45分鐘后給予靜脈注射400pmol kg-1h-1 CCK-8作為對照。 結(jié)果：與基礎分泌相比，側(cè)腦室微量注射obestatin后大鼠胰腺外分泌量及胰液蛋白與基礎相比差異無顯著性（P 0.05），靜脈注射CCK-8可以引起胰腺外分泌量的增加，并于30min后達高峰，差異具有顯著性意義；而胰腺蛋白也呈相應升高，與大鼠基礎分泌相比，差異具有顯著性（P 0.05），obestatin腦室內(nèi)注射并不能改變由CCK-8引起的胰腺外分泌及胰液蛋白的增高。 結(jié)論外周靜脈給予CCK-8增加胰液和胰液蛋白的分泌，側(cè)腦室微量注射obestatin對胰腺外分泌功能無影響，并且不能改變由CCK-8引起的胰液和胰液蛋白的增高。 第五部分十二指腸內(nèi)灌注obestatin對大鼠胰腺外分泌影響的初步研究 目的：采用十二指腸內(nèi)持續(xù)灌注的方法研究不同劑量obestatin對大鼠胰腺外分泌功能的影響 方法：SD大鼠14只，隨機分成2組，麻醉后制作胰腺外分泌模型：所有大鼠用3%戊巴比妥鈉（15mg/kg）腹腔內(nèi)麻醉，，麻醉成功后固定于操作板上，放于75%酒精內(nèi)消毒30分鐘，在上腹部打開腹腔，于胃及十二指腸之間找到胰管及十二指腸乳頭，經(jīng)十二指腸乳頭對側(cè)腸管插入聚乙烯導管（PE-10）約0.5cm，十二指腸乳頭上端插入PE-10以微泵灌注obestatin及回輸膽胰混合液（P-BJ）。模型穩(wěn)定30分鐘后開始實驗，每15分鐘經(jīng)胰管插管收集一次P-BJ測定體積，并留取50ul測定蛋白含量，剩余P-BJ經(jīng)由十二指腸回輸。所有大鼠于實驗開始后15分鐘收集一次P-BJ作為基礎分泌。B組于實驗開始15分鐘后分別給予十二指腸內(nèi)微泵灌注5nmolkg-1h-1obestatin 105分鐘, A組除了不做十二指腸灌注以外，其余處理均同B組。 結(jié)果十二指腸內(nèi)持續(xù)灌注5nomlkg-1h-1obestatin各時點大鼠胰腺外分泌量及胰液蛋白與對照組相比均無顯著性差異（P 0.05）結(jié)論十二指腸內(nèi)持續(xù)灌注obestatin對大鼠胰腺外分泌量及胰液蛋白無影響。 全文小結(jié)：本課題通過采用①建立離體大鼠胰腺腺泡細胞及胰腺小葉，分別與不同濃度的obestatin及腺泡刺激劑(CCK-8)和胰腺小葉刺激劑（KCL）進行共培養(yǎng)，觀察細胞內(nèi)外淀粉酶水平的變化，進而分析obestatin對胰腺外分泌功能的影響；②建立活體麻醉大鼠胰腺外分泌動物模型，靜脈給予不同濃度的obestatin觀察其對胰腺外分泌量及胰液蛋白的影響；并與胰腺刺激劑CCK-8共同注射，觀察其是否與CCK-8存在協(xié)同或拮抗作用。③建立麻醉大鼠胰腺外分泌模型，通過側(cè)腦室微量注射obestatin，觀察其是否能通過中樞神經(jīng)影響大鼠胰腺外分泌功能。④通過十二指腸內(nèi)灌注的方法觀察obestatin對大鼠胰腺外分泌功能的影響，結(jié)果顯示：體外實驗中，外源性obestatin對大鼠胰腺腺泡及胰腺小葉淀粉酶分泌無影響，外周靜脈給予CCK-8可增加胰液和胰液蛋白的分泌；在麻醉大鼠中，靜脈給予obestatin對胰腺外分泌功能無影響，并且不能改變由CCK-8引起的胰液和胰液蛋白的增高。腦室內(nèi)微量注射obestatin對胰腺外分泌功能無影響，并且不能改變由CCK-8引起的胰液和胰液蛋白的增高。單獨十二指腸內(nèi)灌注obestatin對大鼠胰腺外分泌功能無影響。
【圖文】：

o b es ta t in 對 大鼠 胰 腺外 分 泌調(diào) 節(jié) 作 用的 實 驗研 究 入 i n t im a -Ⅱ 靜 脈 留置 針 以 回輸 P - B J； 通 過 紅外 線 烤燈 使大 鼠 肛溫 維 持在 3 7℃左 右 , 模 型 穩(wěn)定 3 0 m i n 后, 每隔 1 5 m i n 收集 一次 P - BJ , 微量 進 樣器 測定 體 積后 留取 5 0 u l 用 雙 蒸水 稀 釋 以測 定蛋 白 含量 , 其 余 部分 P - BJ 在下 一收 集 時段 內(nèi)從 乳頭 上 方留 置 導 管按 照 2 m l /h 回輸 至十 二 指腸 內(nèi)。 收集 1 管 P - B J 作為 胰腺 基礎 分 泌， 以 微 量注 射 泵 按 1 m L/ h 的速 度靜 脈 內(nèi)注 射 o be s ta t in , 并 收 集 2 次 P- B J； o b e st a ti n 注射 后 3 0 分鐘 ，給 予 股靜 脈 內(nèi)微 泵 注 射 4 0 0 pm o lk g- 1h- 1C C K -8 。 C 組只 注射 4 0 0 pm o lk g- 1h- 1C C K -8 作為 對照 。 09期 孫學成：Obestatin對大鼠胰腺外分泌調(diào)節(jié)作用的實驗研究 E064-

圖 2示 B C A檢 測 原理 白 檢 測步 驟 ( 見 圖3 ) ： 9 6 孔板 ，在 每 個孔 中 加入 5 μl 的蛋 白標 準 品或 蛋 白 加入 1 0 0 ul B C A 工作 試 劑， 輕 微震 蕩混 勻 3 0 秒， 用 不 1 5m i n。 板 ，放 冷 至室 溫 。 上進 行 5 62 n m的 讀 數(shù)。 曲線 ， 根據(jù) 標 準曲 線 進 行蛋 白樣 品 濃度 的 計算 （ 見 表
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R576

【參考文獻】

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1 張樺,蔡德鴻,徐春生,陳宏,劉宏;一種簡易高效的大鼠胰島分離純化方法[J];第一軍醫(yī)大學學報;2001年02期

2 王連才;馬清涌;沙煥臣;馬振華;張梅;;白藜蘆醇對重癥急性胰腺炎鈣離子調(diào)節(jié)失衡的影響[J];中華普通外科雜志;2005年12期

3 何忠野;郭仁宣;;一種簡易經(jīng)濟的大鼠胰腺腺泡細胞分離提純方法[J];中國普通外科雜志;2006年11期

本文編號：2643828