【摘要】：Obestatin(肥胖抑制素)是最近從大鼠胃組織中發(fā)現(xiàn)的一種新的腦腸肽。它是一種ghrelin相關(guān)肽，與ghrelin來(lái)自同一基因。obestatin與ghrelin在調(diào)節(jié)攝食、胃腸生理等方面作用完全相反，被認(rèn)為是一對(duì)“陰陽(yáng)”肽。ghrelin也稱為食欲刺激素，是一種由23個(gè)氨基酸組成的腦腸肽，生長(zhǎng)激素促分泌素受體（growth hormone secretagogue receptor，GHSR）為其受體，ghrelin對(duì)胰腺外分泌也具有重要的調(diào)節(jié)作用，主要表現(xiàn)為促進(jìn)胰腺外分泌，其機(jī)制是通過(guò)迷走-迷走神經(jīng)通路發(fā)揮作用的。雖然obestatin和ghrelin來(lái)源于同一前體proghrelin，但obestatin自發(fā)現(xiàn)以來(lái)就充滿了各種爭(zhēng)議，2005年，Zhang等首先在胃黏膜中發(fā)現(xiàn)并命名了obestatin，在最初的功能研究中，腹腔和側(cè)腦室注射人源性obestatin可以抑制大鼠的食欲，減少體重，進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)：obestatin可以抑制渴感和焦慮、提高大鼠的記憶力、抑制前脂肪細(xì)胞的增長(zhǎng)、控制機(jī)體的水代謝。在人體的研究當(dāng)中，部分研究者發(fā)現(xiàn)在肥胖人群里，胃黏膜中obestatin表達(dá)量和血循環(huán)中obestatin含量均出現(xiàn)減少，因此他們推測(cè)obestatin在調(diào)節(jié)機(jī)體能量代謝方面發(fā)揮了重要作用，是ghrelin的拮抗劑。盡管有以上證據(jù)證明obestatin存在生物學(xué)作用，但絕大多數(shù)研究應(yīng)用了大劑量范圍的obestatin、不同的實(shí)驗(yàn)方法、不同的動(dòng)物及不同來(lái)源的obestatin并未得出相同結(jié)論，因此有研究者提出應(yīng)該重新命名obestatin。除了對(duì)obestatin生物學(xué)功能方面存在疑問(wèn)外，對(duì)其受體也存在著爭(zhēng)論：其發(fā)現(xiàn)者首次報(bào)道了G蛋白偶聯(lián)受體39（GPR39）是obestatin的天然受體，結(jié)合實(shí)驗(yàn)也證明GPR39廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、外周重要器官，而以胃腸道的含量最高。后來(lái)的三個(gè)實(shí)驗(yàn)室并未證明GPR39為obestatin的固有受體，因此對(duì)發(fā)現(xiàn)者的研究提出了質(zhì)疑，對(duì)于以上質(zhì)疑，2007年Zhang重復(fù)了自己的實(shí)驗(yàn)并得出他們實(shí)驗(yàn)室不能證明GPR39是obestatin受體的結(jié)論。因此對(duì)obestatin的研究還存在以下疑問(wèn)：(1)在obestatin本身方面：在體內(nèi)這種分子是否真正存在?如果存在到底有怎樣的生理功能功能?是否能拮抗ghrelin的生理作用?它是否受到中樞及其他激素的調(diào)控?(2)在外源性分子方面：人工合成的外源性obestatin多肽分子是否具有與內(nèi)源性分子相同的空間結(jié)構(gòu)及生物活性? (3)在obestatin受體方面：obestatin是否通過(guò)GPR39受體發(fā)揮作用？是否還有別的作用途徑?(4)在研究方法方面：利用人工合成的obestatin抗體，檢測(cè)到的僅僅是obestatin，還是包括了無(wú)實(shí)際作用的preproghrelin或proghrelin？ 胰腺的外分泌功能受到中樞神經(jīng)和腸神經(jīng)以及大量的激素和腦腸肽組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)，業(yè)已證實(shí)：膽囊收縮素（CCK）、促胰液素、胰多肽、ghrelin、血管活性多肽、蛙皮素和胃動(dòng)素等激素可以刺激胰腺的外分泌；而生長(zhǎng)抑素、胰高糖素、降鈣素、腎上腺素和去甲腎上腺素等可以抑制胰腺的外分泌，由于對(duì)obestatin功能及受體研究存在著大量的爭(zhēng)論，并且obestatin對(duì)胰腺外分泌功能的調(diào)節(jié)作用目前還不清楚。本研究擬采用大鼠離體腺泡、小葉及在體胰腺外分泌功能研究模型，應(yīng)用分離大鼠離體腺泡細(xì)胞和胰腺小葉、靜脈持續(xù)注射、側(cè)腦室內(nèi)微量注射等技術(shù)明確obestatin對(duì)胰腺外分泌功能的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制，并觀察obestatin及其它腦腸肽對(duì)大鼠胰腺外分泌調(diào)節(jié)的交互作用，用膽囊收縮素作為陽(yáng)性對(duì)照，從而進(jìn)一步完善胰腺外分泌調(diào)節(jié)的機(jī)制和obestatin的生物學(xué)功能。 第一部分一種改良的胰腺腺泡提取方法 目的：對(duì)經(jīng)典的Williams提取胰腺腺泡方法進(jìn)行改良，以期探索一種簡(jiǎn)便，經(jīng)濟(jì)和穩(wěn)定的胰腺腺泡分離純化的新方法。 方法：雄性SD大鼠，鼠齡8-10w，體重200-250g。在無(wú)菌條件下，以3%戊巴比妥鈉，按照15mg/kg劑量腹腔內(nèi)注射麻醉后固定于解剖板上，然后放于75%酒精內(nèi)消毒30分鐘，在無(wú)菌操作臺(tái)上于劍突下3cm處腹部正中，分層剪開皮膚、腹��；循胃、十二指腸球降部及脾臟之間取出胰腺。室溫下（23℃）在充過(guò)氧的Hepes液中將血跡沖洗干凈，并用鑷子輕輕的將胰腺周圍脂肪、淋巴結(jié)以及腹膜剔除。以低濃度Ⅰ型膠原酶（0.3mg/ml）作為腺泡細(xì)胞分離液，用帶有1ml注射器針頭的注射器在大鼠胰腺間質(zhì)內(nèi)多點(diǎn)注射使胰腺小葉展開，5分鐘后用小剪刀將其剪成1～2mm碎塊放于含100%氧分離液中震蕩消化50分鐘，然后經(jīng)過(guò)過(guò)濾，離心、再懸浮等過(guò)程成功提取大鼠胰腺腺泡。 結(jié)果：平均每只大鼠可以提取5～6×106個(gè)細(xì)胞，經(jīng)HE和臺(tái)盼藍(lán)染色，細(xì)胞存活率大于90%，細(xì)胞純化率為(70±6)％與王連才方法相比差異無(wú)顯著性。 結(jié)論：我們認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)室采用的改進(jìn)方法是一種簡(jiǎn)便，經(jīng)濟(jì)和穩(wěn)定的腺泡分離純化方法。 第二部分Obestatin對(duì)大鼠胰腺腺泡/小葉淀粉酶影響 目的：研究不同劑量肥胖抑制素對(duì)大鼠離體胰腺腺泡及胰腺小葉淀粉酶分泌的影響。 材料與方法：雄性SD大鼠，鼠齡8-10w，體重200-250g，36只。采用改良的Williams法體外分離大鼠胰腺腺泡（方法同第一部分），將胰腺腺泡與不同濃度obestatin（0.1、1、10、30nmol/L）在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h。在對(duì)照組腺泡中，加入膽囊收縮素（CCK-8，10-10mol/L）和obestatin共培養(yǎng)1h，測(cè)定培養(yǎng)液中上清測(cè)定淀粉酶水平，將剩余腺泡細(xì)胞放于超聲破碎儀打碎（5分鐘），離心后去上清測(cè)定淀粉酶水平。參照Scheele＆Palade法提取胰腺小葉：在無(wú)菌條件下，以3%戊巴比妥鈉，按照15mg/kg劑量腹腔內(nèi)注射麻醉后固定于解剖板上，放于75%的酒精內(nèi)消毒30分鐘，在無(wú)菌操作臺(tái)上于劍突下3cm處腹部正中，分層剪開皮膚、腹��；循胃、十二指腸球降部及脾臟之間取出胰腺。室溫下（23℃）在充過(guò)氧的KHB液中將血跡沖洗干凈，并用鑷子將胰腺周圍脂肪、淋巴結(jié)以及腹膜剔除。分離含有胰腺內(nèi)神經(jīng)末端、胰島細(xì)胞及外分泌細(xì)胞的胰腺小葉（大小4mm～5mm），胰腺小葉與obestatin共培養(yǎng)30min，對(duì)照組中KCL（75mmol/L）和obestatin共培養(yǎng)30min，取上清測(cè)定淀粉酶水平，將剩余胰腺小葉組織放于組織勻漿器中打碎，離心后測(cè)定上清液中淀粉酶水平。 結(jié)果：obestatin不影響胰腺腺泡和胰腺小葉淀粉酶釋放，且不隨濃度的增高而改變(P 0.05)。CCK-8和KCL能分別刺激胰腺腺泡、胰腺小葉淀粉酶釋放（P0.05），而外源性obestatin對(duì)CCK-8和KCL引起的胰腺腺泡和胰腺小葉淀粉酶分泌增加無(wú)影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 0.05）。 結(jié)論：體外實(shí)驗(yàn)中，外源性obestatin對(duì)大鼠胰腺腺泡及胰腺小葉淀粉酶分泌無(wú)影響，obestatin對(duì)活體大鼠胰腺外分泌影響需要進(jìn)一步研究。 第三部分靜脈注射obestatin對(duì)大鼠胰腺外分泌的影響 目的：采用靜脈持續(xù)注射的方法研究不同劑量肥胖抑制素對(duì)大鼠胰腺外分泌功能的影響。 材料與方法：24只SD大鼠隨機(jī)分成3組（N=8），麻醉后制作胰腺外分泌模型：所有大鼠用3%戊巴比妥鈉（15mg/kg）腹腔內(nèi)麻醉，麻醉成功后固定于操作板上，放于75%酒精內(nèi)消毒30分鐘，腹中線上逐層切開上腹部約3cm，于胃及十二指腸之間找到胰管及十二指腸乳頭，經(jīng)十二指腸乳頭對(duì)側(cè)腸管插入聚乙烯導(dǎo)管（PE-10）約0.5cm,尾靜脈及右側(cè)股動(dòng)脈留置輸液導(dǎo)管，十二指腸乳頭上端插入PE-10以回輸膽胰混合液（P-BJ）。模型穩(wěn)定30分鐘后開始實(shí)驗(yàn)，每15分鐘經(jīng)胰管插管收集一次P-BJ測(cè)定體積，并留取50ul測(cè)定蛋白含量，剩余P-BJ經(jīng)由十二指腸回輸。所有大鼠于實(shí)驗(yàn)開始后15分鐘收集一次P-BJ作為基礎(chǔ)分泌。A組和B組于實(shí)驗(yàn)開始15分鐘后分別給予尾靜脈持續(xù)微泵注射1nmolkg-1h-1obestatin和5nmolkg-1h-1 obestatin，45分鐘后給予股靜脈微泵注射400pmolkg-1h-1 CCK-8；C組于實(shí)驗(yàn)開始45分鐘后給予股靜脈注射400pmolkg-1h-1CCK-8作為對(duì)照。 結(jié)果：靜脈注射CCK-8 15min后胰腺分泌量開始增高，并于30min后達(dá)高峰，而胰腺蛋白也呈相應(yīng)升高，差異均具有顯著性（P 0.05），單獨(dú)靜脈注射obestatin對(duì)大鼠胰腺外分泌量及胰液蛋白無(wú)影響（P 0.05），obestatin與CCK-8同時(shí)注射并不能改變由CCK-8引起的胰腺外分泌及胰液蛋白的增高。結(jié)論：外周靜脈給予CCK-8可增加胰液和胰液蛋白的分泌，靜脈注射obestatin對(duì)胰腺外分泌功能無(wú)影響，并且不能改變由CCK-8引起的胰液和胰液蛋白的增高。 第四部分腦室微量注射obestatin對(duì)大鼠胰腺外分泌的影響 目的采用側(cè)腦室微量注射的方法研究肥胖抑制素對(duì)大鼠胰腺外分泌功能的影響。 方法SD大鼠隨機(jī)分成3組（A,B,C組），麻醉后制作胰腺外分泌模型：所有大鼠用3%戊巴比妥鈉（15mg/kg）腹腔內(nèi)麻醉，麻醉成功后固定于操作板上，放于75%酒精內(nèi)消毒30分鐘，沿著腹中線逐層切開上腹部約3cm，于胃及十二指腸之間找到胰管及十二指腸乳頭，經(jīng)十二指腸乳頭對(duì)側(cè)腸管插入聚乙烯導(dǎo)管（PE-10）約0.5cm,尾靜脈留置輸液導(dǎo)管，十二指腸乳頭上端插入PE-10以回輸膽胰混合液（P-BJ）。模型穩(wěn)定30分鐘后開始實(shí)驗(yàn)，每15分鐘經(jīng)胰管插管收集一次P-BJ測(cè)定體積，并留取50ul測(cè)定蛋白含量，剩余P-BJ經(jīng)由十二指腸回輸。所有大鼠于實(shí)驗(yàn)開始后15分鐘收集一次P-BJ作為基礎(chǔ)分泌。A組和B組于實(shí)驗(yàn)開始15分鐘后分別給予側(cè)腦室微量注射30nmolkg-1obestatin,C組于實(shí)驗(yàn)開始45分鐘后給予靜脈注射400pmol kg-1h-1 CCK-8作為對(duì)照。 結(jié)果：與基礎(chǔ)分泌相比，側(cè)腦室微量注射obestatin后大鼠胰腺外分泌量及胰液蛋白與基礎(chǔ)相比差異無(wú)顯著性（P 0.05），靜脈注射CCK-8可以引起胰腺外分泌量的增加，并于30min后達(dá)高峰，差異具有顯著性意義；而胰腺蛋白也呈相應(yīng)升高，與大鼠基礎(chǔ)分泌相比，差異具有顯著性（P 0.05），obestatin腦室內(nèi)注射并不能改變由CCK-8引起的胰腺外分泌及胰液蛋白的增高。 結(jié)論外周靜脈給予CCK-8增加胰液和胰液蛋白的分泌，側(cè)腦室微量注射obestatin對(duì)胰腺外分泌功能無(wú)影響，并且不能改變由CCK-8引起的胰液和胰液蛋白的增高。 第五部分十二指腸內(nèi)灌注obestatin對(duì)大鼠胰腺外分泌影響的初步研究 目的：采用十二指腸內(nèi)持續(xù)灌注的方法研究不同劑量obestatin對(duì)大鼠胰腺外分泌功能的影響 方法：SD大鼠14只，隨機(jī)分成2組，麻醉后制作胰腺外分泌模型：所有大鼠用3%戊巴比妥鈉（15mg/kg）腹腔內(nèi)麻醉，，麻醉成功后固定于操作板上，放于75%酒精內(nèi)消毒30分鐘，在上腹部打開腹腔，于胃及十二指腸之間找到胰管及十二指腸乳頭，經(jīng)十二指腸乳頭對(duì)側(cè)腸管插入聚乙烯導(dǎo)管（PE-10）約0.5cm，十二指腸乳頭上端插入PE-10以微泵灌注obestatin及回輸膽胰混合液（P-BJ）。模型穩(wěn)定30分鐘后開始實(shí)驗(yàn)，每15分鐘經(jīng)胰管插管收集一次P-BJ測(cè)定體積，并留取50ul測(cè)定蛋白含量，剩余P-BJ經(jīng)由十二指腸回輸。所有大鼠于實(shí)驗(yàn)開始后15分鐘收集一次P-BJ作為基礎(chǔ)分泌。B組于實(shí)驗(yàn)開始15分鐘后分別給予十二指腸內(nèi)微泵灌注5nmolkg-1h-1obestatin 105分鐘, A組除了不做十二指腸灌注以外，其余處理均同B組。 結(jié)果十二指腸內(nèi)持續(xù)灌注5nomlkg-1h-1obestatin各時(shí)點(diǎn)大鼠胰腺外分泌量及胰液蛋白與對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異（P 0.05）結(jié)論十二指腸內(nèi)持續(xù)灌注obestatin對(duì)大鼠胰腺外分泌量及胰液蛋白無(wú)影響。 全文小結(jié)：本課題通過(guò)采用①建立離體大鼠胰腺腺泡細(xì)胞及胰腺小葉，分別與不同濃度的obestatin及腺泡刺激劑(CCK-8)和胰腺小葉刺激劑（KCL）進(jìn)行共培養(yǎng)，觀察細(xì)胞內(nèi)外淀粉酶水平的變化，進(jìn)而分析obestatin對(duì)胰腺外分泌功能的影響；②建立活體麻醉大鼠胰腺外分泌動(dòng)物模型，靜脈給予不同濃度的obestatin觀察其對(duì)胰腺外分泌量及胰液蛋白的影響；并與胰腺刺激劑CCK-8共同注射，觀察其是否與CCK-8存在協(xié)同或拮抗作用。③建立麻醉大鼠胰腺外分泌模型，通過(guò)側(cè)腦室微量注射obestatin，觀察其是否能通過(guò)中樞神經(jīng)影響大鼠胰腺外分泌功能。④通過(guò)十二指腸內(nèi)灌注的方法觀察obestatin對(duì)大鼠胰腺外分泌功能的影響，結(jié)果顯示：體外實(shí)驗(yàn)中，外源性obestatin對(duì)大鼠胰腺腺泡及胰腺小葉淀粉酶分泌無(wú)影響，外周靜脈給予CCK-8可增加胰液和胰液蛋白的分泌；在麻醉大鼠中，靜脈給予obestatin對(duì)胰腺外分泌功能無(wú)影響，并且不能改變由CCK-8引起的胰液和胰液蛋白的增高。腦室內(nèi)微量注射obestatin對(duì)胰腺外分泌功能無(wú)影響，并且不能改變由CCK-8引起的胰液和胰液蛋白的增高。單獨(dú)十二指腸內(nèi)灌注obestatin對(duì)大鼠胰腺外分泌功能無(wú)影響。
【圖文】：

o b es ta t in 對(duì) 大鼠 胰 腺外 分 泌調(diào) 節(jié) 作 用的 實(shí) 驗(yàn)研 究 入 i n t im a -Ⅱ 靜 脈 留置 針 以 回輸 P - B J； 通 過(guò) 紅外 線 烤燈 使大 鼠 肛溫 維 持在 3 7℃左 右 , 模 型 穩(wěn)定 3 0 m i n 后, 每隔 1 5 m i n 收集 一次 P - BJ , 微量 進(jìn) 樣器 測(cè)定 體 積后 留取 5 0 u l 用 雙 蒸水 稀 釋 以測(cè) 定蛋 白 含量 , 其 余 部分 P - BJ 在下 一收 集 時(shí)段 內(nèi)從 乳頭 上 方留 置 導(dǎo) 管按 照 2 m l /h 回輸 至十 二 指腸 內(nèi)。 收集 1 管 P - B J 作為 胰腺 基礎(chǔ) 分 泌， 以 微 量注 射 泵 按 1 m L/ h 的速 度靜 脈 內(nèi)注 射 o be s ta t in , 并 收 集 2 次 P- B J； o b e st a ti n 注射 后 3 0 分鐘 ，給 予 股靜 脈 內(nèi)微 泵 注 射 4 0 0 pm o lk g- 1h- 1C C K -8 。 C 組只 注射 4 0 0 pm o lk g- 1h- 1C C K -8 作為 對(duì)照 。 09期 孫學(xué)成：Obestatin對(duì)大鼠胰腺外分泌調(diào)節(jié)作用的實(shí)驗(yàn)研究 E064-

圖 2示 B C A檢 測(cè) 原理 白 檢 測(cè)步 驟 ( 見 圖3 ) ： 9 6 孔板 ，在 每 個(gè)孔 中 加入 5 μl 的蛋 白標(biāo) 準(zhǔn) 品或 蛋 白 加入 1 0 0 ul B C A 工作 試 劑， 輕 微震 蕩混 勻 3 0 秒， 用 不 1 5m i n。 板 ，放 冷 至室 溫 。 上進(jìn) 行 5 62 n m的 讀 數(shù)。 曲線 ， 根據(jù) 標(biāo) 準(zhǔn)曲 線 進(jìn) 行蛋 白樣 品 濃度 的 計(jì)算 （ 見 表
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R576

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 張樺,蔡德鴻,徐春生,陳宏,劉宏;一種簡(jiǎn)易高效的大鼠胰島分離純化方法[J];第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2001年02期

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3 何忠野;郭仁宣;;一種簡(jiǎn)易經(jīng)濟(jì)的大鼠胰腺腺泡細(xì)胞分離提純方法[J];中國(guó)普通外科雜志;2006年11期

本文編號(hào)：2643828