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中縫背核nesfatin-1對(duì)大鼠內(nèi)臟敏感性的影響及可能機(jī)制研究

發(fā)布時(shí)間:2020-04-28 08:42
【摘要】:【背景】腸易激綜合征(Irritable bowel syndrome,IBS)是以慢性反復(fù)發(fā)作腹痛以及排便習(xí)慣的改變?yōu)樘卣鞯墓δ苄晕改c道疾病,臨床檢查無明顯器質(zhì)性改變。盡管是一種較為常見的腸道疾病,它對(duì)患者的生活質(zhì)量以及工作造成了嚴(yán)重的影響。IBS的病生理學(xué)機(jī)制目前仍未完全明確,普遍認(rèn)為內(nèi)臟高敏感是其主要的發(fā)病機(jī)制之一。5-HT(5-hydroxytryptamine)與IBS患者內(nèi)臟高敏感密切相關(guān),5-HT受體拮抗劑以及三環(huán)類抗抑郁藥對(duì)IBS的治療作用提示中樞5-HT系統(tǒng)在IBS內(nèi)臟感覺過敏發(fā)病機(jī)制中起重要作用。有研究報(bào)道,母嬰分離內(nèi)臟高敏感大鼠結(jié)直腸擴(kuò)張后中縫背核(dorsal raphe nucleus,DRN)5-HT能神經(jīng)元激活數(shù)目較正常對(duì)照組明顯增加,電針可以通過降低中縫背核5-HT神經(jīng)元的高表達(dá)而減輕母嬰分離大鼠內(nèi)臟高敏感性,提示中縫背核5-HT神經(jīng)元在內(nèi)臟疼痛調(diào)控中有很重要的作用。Nesfatin-1是由核組蛋白2(nucleobindin 2,NUCB2)裂解后產(chǎn)生的一種厭食肽。除了具有抑制攝食作用外,我們的前期研究還發(fā)現(xiàn)nesfatin-1與內(nèi)臟高敏感有關(guān)。Nesfatin-1在中縫背核與5-HT共表達(dá),母嬰分離大鼠通過中縫背核5-HT高表達(dá)導(dǎo)致內(nèi)臟高敏感,側(cè)腦室注射nesfatin-1可以激活中縫背核5-HT能神經(jīng)元,因此我們推測中縫背核nesfatin-1可能通過激活5-HT途徑增加內(nèi)臟高敏感。本研究采用新生期母嬰分離大鼠內(nèi)臟高敏感模型,中縫背核5-HT及色氨酸羥化酶(tryptophan hydroxylase,TPH,5-HT合成限速酶)免疫陽性神經(jīng)元代表中縫背核5-HT神經(jīng)元,初步探討中縫背核的nesfatin-1對(duì)大鼠內(nèi)臟敏感性的影響及可能的機(jī)制。【研究目的】采用新生期母嬰分離方法來建立大鼠的內(nèi)臟高敏感模型,初步探討中縫背核nesfatin-1對(duì)大鼠內(nèi)臟敏感性的影響及可能的機(jī)制!痉椒ā1.新生雄性SD大鼠被隨機(jī)分成母嬰分離組和正常對(duì)照組,從出生后的第2-21天,母嬰分離組組大鼠每天將其與母鼠分開3h,具體操作方法如下:每天早上8:00到11:00之間,將幼鼠從其母鼠籠中取出,置于另外一個(gè)鼠籠中,并將該鼠籠放在另外一個(gè)房間,使其與母鼠分離,其余時(shí)間幼鼠與母鼠共籠飼養(yǎng)。而正常對(duì)照組大鼠不與母鼠分離。在出生后第3周和第8周分別觀察兩組大鼠體質(zhì)量的變化情況。2.通過檢測大鼠在不同結(jié)直腸擴(kuò)張壓力(20 mmHg、40 mmHg、60 mmHg和80mmHg)刺激下的腹壁撤退反射(abdominal withdrawal reflex,AWR)評(píng)分和腹外斜肌肌電圖(electromyographic,EMG)曲線下面積(area under the curve,AUC)來評(píng)估大鼠的內(nèi)臟敏感性。3.出生8周時(shí)觀察母嬰分離組和正常對(duì)照組大鼠在不同強(qiáng)度結(jié)直腸擴(kuò)張壓力刺激時(shí)的AWR評(píng)分和腹外斜肌EMG曲線下面積,然后用免疫組化方法比較兩組大鼠中縫背核nesfatin-1/NUCB2以及TPH的表達(dá)。4.取母嬰分離大鼠隨機(jī)分成2組,分別給予抗nesfatin-1/NUCB2抗體或溶劑對(duì)照中縫背核內(nèi)注射,2h后分別檢測該2組大鼠在結(jié)直腸擴(kuò)張刺激時(shí)AWR評(píng)分和EMG曲線下面積,然后用免疫組化方法比較2組大鼠中縫背核5-HT以及TPH的表達(dá)情況。5.取正常大鼠隨機(jī)分成2組,分別給予nesfatin-1或溶劑對(duì)照中縫背核內(nèi)注射,連續(xù)注射7天,第7天時(shí)觀察2組大鼠在結(jié)直腸擴(kuò)張刺激時(shí)的AWR評(píng)分和EMG曲線下面積,然后用免疫組化方法比較2組大鼠中縫背核5-HT以及TPH的表達(dá)情況。【結(jié)果】1.母嬰分離組大鼠在出生后第3周時(shí)的體重和正常對(duì)照組無明顯差別(P0.05),而出生后第8周時(shí)的體重則要明顯低于正常對(duì)照組大鼠,兩者之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.在結(jié)直腸擴(kuò)張壓力分別為40、60和80mmHg時(shí),母嬰分離組大鼠的AWR評(píng)分以及EMG曲線下面積均明顯高于正常對(duì)照組(P0.05)。3.母嬰分離組大鼠中縫背核中nesfatin-1/NUCB2及TPH免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)均明顯高于正常對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.母嬰分離大鼠中縫背核內(nèi)注射抗nesfatin-1/NUCB2抗體后,在結(jié)直腸擴(kuò)張壓力為40、60和80mmHg時(shí)的AWR評(píng)分及各個(gè)壓力下的EMG曲線下面積均明顯低于溶劑對(duì)照組(P0.05),并且中縫背核中5-HT和TPH免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元的數(shù)量也明顯下降(P0.05)。5.正常對(duì)照大鼠中縫背核內(nèi)注射nesfatin-1后,在結(jié)直腸擴(kuò)張壓力為40、60和80mmHg時(shí)的AWR評(píng)分和EMG曲線下面積均明顯高于溶劑對(duì)照組(P0.05);并且中縫背核中5-HT及TPH免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元的數(shù)量也顯著增加(P0.05)!窘Y(jié)論】中縫背核nesfatin-1參與了大鼠內(nèi)臟高敏感的發(fā)生,潛在機(jī)制可能與激活中縫背核5-HT能神經(jīng)元有關(guān)。
【圖文】:

埋置,微注射,圖片,導(dǎo)管


用濃度為 10%的水合氯醛(0.3ml/100g wt,IP)麻醉大鼠,進(jìn)行 DRN 核團(tuán)內(nèi)微注射導(dǎo)管埋置術(shù)。將大鼠頭部置于腦立體定位儀上,通過調(diào)節(jié)門齒桿和耳桿使顱骨保持平行;將大鼠頭部的部分毛發(fā)剃除,頭部皮膚經(jīng)碘伏消毒后酒精脫碘,用經(jīng)過高壓消毒的眼科手術(shù)剪輕輕剪開大鼠頭部皮膚,呈長約 1.5cm 矢狀切口,棉簽逐層分離皮下組織到達(dá)顱骨膜;用蘸有少量雙氧水的棉簽輕輕涂抹顱骨表面,暴露出前囟(Bregma)及人字點(diǎn),在立體定位儀引導(dǎo)下 DRN 核團(tuán)內(nèi)置入微注射導(dǎo)管,坐標(biāo)參照 George Paxinos&Charles Watson 大鼠腦立體定位圖譜第五版【58】,DRN 坐標(biāo):前囟(Bregma)后 8mm;左側(cè)/右側(cè) 0mm;深度為5.8mm。用顱骨鉆在導(dǎo)管的前方兩側(cè)分別鉆兩個(gè)小孔,使兩個(gè)小孔和導(dǎo)管之間構(gòu)成一個(gè)三角形,注意鉆孔時(shí)動(dòng)作要輕柔避免傷及腦實(shí)質(zhì),孔徑不宜過大,將兩枚不銹鋼螺絲釘置于小孔內(nèi),然后用牙科水泥覆蓋以固定導(dǎo)管。手術(shù)結(jié)束后分別對(duì)大鼠進(jìn)行編號(hào),置于單獨(dú)的鼠籠中以避免相互破壞手術(shù)部位,手術(shù)后大鼠恢復(fù)一周。

中縫背核,中腦導(dǎo)水管,微注射,導(dǎo)管


圖 2 微注射導(dǎo)管位于中縫背核內(nèi) (Aq:中腦導(dǎo)水管; DRN:中縫背核)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS24.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處理,所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用準(zhǔn)差(Mean±SD)來表示,結(jié)直腸擴(kuò)張后內(nèi)臟敏感性(包括大鼠測得的 以及腹外斜肌 EMG 曲線下面積)采用雙因素重復(fù)測量方差分析進(jìn)行統(tǒng)若有差異,,則用 Bonferroni 事后檢定進(jìn)行兩兩比較。中縫背核免疫陽性量的比較則運(yùn)用獨(dú)立樣本的 t 檢驗(yàn),P <0.05 認(rèn)為各組間的差異有統(tǒng)計(jì)
【學(xué)位授予單位】:南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:博士
【學(xué)位授予年份】:2018
【分類號(hào)】:R574

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2 楊s

本文編號(hào):2643273


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